混菌固態發酵小曲白酒糟生產蛋白飼料的研究

王 炫，汪江波，薛棟升

（湖北工業大學輕工學部，湖北 武漢430068）

我國是白酒生產大國，酒糟年產量超過3 000萬t［1］。由于白酒糟水分大，酸度高，極易腐爛變質，不易保管和運輸，除一部分白酒糟用作飼料或肥料，大部分成為廢棄物，既浪費資源，又污染環境［2］。據分析，由于酒糟中含有淀粉（10%左右）、粗纖維（20%左右）、粗蛋白（7%～9%）［3］，能量和玉米幾乎相當，且酒糟中含有微量的氨基酸，豐富的有機酸、磷脂和維生素，但直接作為飼料，動物適口性不好且不利于動物營養吸收［4］。本文探討以混合菌種為發酵菌進行酒糟發酵生產飼料的工藝條件，以改善酒糟作為飼料的營養組成的，得到一種動物適口性好、營養豐富、易被動物吸收的生物活性蛋白飼料，為飼料生產提供新的蛋白質來源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料和配料 酒糟由勁牌有限公司陽新楓林酒廠提供，初始含水量為70.0%；麩皮購于武漢南湖農貿市場，初始含水量1.3%。

1.1.2 菌 種 白 地 霉 （Geotrichu m candidiu m，G.），購于武漢大學微生物保藏中心；產軟假絲酵母（Candida utilis，C.），實驗室保藏菌種。

1.1.3 培養基 YPD培養基（種子培養基）：酵母膏，1%；蛋白胨，2%；葡萄糖，2%；水，1 000 mL；調整p H 至6.0，用于活化白地霉（G.）；調整p H 至6.5，用于活化產朊假絲酵母（C.）。

基本發酵培養基：酒糟與麩皮的干重比例（糟麩比）為9∶1，按基質干重添加5%葡萄糖，0.5%CO（NH2）2、0.5% （NH4）2SO4、0.5%KH2PO4、0.1%MgSO4無機鹽，調整含水量為60%，并用Na OH調整p H至5.0。

1.2 主要儀器及試劑

見表1、表2.

1.3 分析方法

分析方法見表3.

表1 主要儀器

表2 主要試劑

表3 分析方法匯總

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化 斜面菌種一環→接種到YPD液體培養基→搖床（30℃，48h，180 r／min）→一級種子。

1.4.2 菌種的擴大培養 YPD液體培養基→分裝三角瓶（250 mL）→滅菌（115℃，30 min）→接種一級種子→培養（30℃，48 h，180 r／mi m）→二級種子。

1.4.3 發酵培養 發酵培養基→分裝三角瓶（500 mL）→滅菌→纖維素酶預處理（50℃、6 h）→接種（二級種子，接種量10%，V（G.）∶V（C.）＝1∶1）→培養（30℃，72 h，發酵24 h扣瓶）。

2 結果與討論

試驗采取纖維素酶預處理酒糟，將其中的粗纖維降解為G.和C.可以利用的小分子的物質以供菌種生長并積累蛋白質；添加麩皮補充氮源的同時，調整基質的疏松度，增加基質含氧量。

2.1 菌種生長曲線的測定

采用比濁法［6］確定G.和C.的生長曲線。一級種子分別接種于YPD培養基中，培養12 h后，每隔2 h取樣，用可見分光光度計測其OD值（測定波長為620 n m），記錄數據，并將所測的OD值與其對應的培養時間作圖，分別繪出G.和C.（YPD培養基，30℃，180 r／min）的生長曲線（圖1）。所以，使用培養36 h的二級種子作為發酵菌種。

2.2 糟麩比對固態發酵的影響

培養基配方是充分利用原料中的營養物質，最大限度完成生物轉化量的基礎［7］。以酒糟和麩皮（總干重20 g）為主要原料，V（酒糟）∶V（麩皮）分別按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4配制發酵培養基，其他組成與基本發酵培養基一致，纖維素酶預處理后，接種G.和C.，30℃培養72h，烘干，測其蛋白質含量，確定最佳糟麩比。定性檢測硫酸銨和尿素剩余與否［5］。

圖1 菌種G.和C.的生長曲線

由圖2可知，添加麩皮比不添加的效果好，同時隨著麩皮所占比例增大，蛋白含量也增加，但所增幅度不大，所以選擇糟麩比為9∶1來配置發酵培養基。

圖2 糟麩比對蛋白含量的影響

2.3 纖維素酶預處理對固態發酵的影響

小曲白酒的原料經過糖化和發酵，纖維素在酒糟中的比例明顯增高，添加纖維素酶［8］以降解粗纖維，以白地霉和假絲酵母來積累蛋白［9－10］。進行纖維素酶添加量（預處理時間為6 h）和預處理時間（纖維素酶添加量為3%）對固態發酵影響的試驗，試驗結果見圖3和圖4。

圖3 纖維素酶添加量對固體發酵的影響

圖4 纖維素酶預處理時間對固體發酵的影響

由圖3和4可知，隨著纖維素酶的添加量和預處理時間的增加，蛋白含量也會隨著增加；纖維素酶量的增加到5%后，蛋白含量的增量不明顯，說明5%的纖維素酶足以將底物分解，確定5%的纖維素酶添加量；經12 h 50℃高溫處理，蛋白含量可達到29.672 0%，隨時間的延續，蛋白含量反而降低，這可能與高溫下酶的半衰期縮短導致酶不能完全降解纖維素有關，但預處理時間增長至24 h時，蛋白含量有上升趨勢，這可能與菌種在發酵初期有足夠的由纖維素酶降解的小分子物質而大量生長。在最適溫度下，預處理對蛋白的積累有益，但為了達到最好的生產效益，初步確定預處理時間約為12 h。

2.4 初始p H值對固態發酵的影響

由于發酵采用白地霉和假絲酵母混合菌種，兩菌種生長的最適p H有所差異，而固態發酵過程中不必對微生物生長環境中的p H加以測控，只要調好培養基的初始p H［11］。

由圖5可知，培養基初始p H5.0時，菌體蛋白含量最高28.329 8%。在發酵過程中，代謝產物的積累會影響菌種發酵能力，如酵母通過活躍分泌的H＋到培養基中降低p H值，固態發酵基質的緩沖能力較大，p H的變化不會太大，故確定發酵初始p H值5.0作為發酵p H值。

2.5 初始含水量對固態發酵的影響

固態發酵的最大特點是沒有游離水，因此基質含水量的變化必然會對微生物的生長及代謝能力產生重要影響［11］。對發酵培養基的初始含水量設置梯度，進行試驗。

圖5 初始p H值對酒糟固態發酵生產蛋白飼料的影響

由圖6可知，隨著初始含水量的上升，蛋白含量先上升后下降，70%的初始含水量，得到的發酵產物的粗蛋白含量最高。這是由于含水量低則造成基質膨脹程度低，微生物生長受到抑制，發酵后期微生物生長及蒸發使物料較干，微生物難以生長，產量降低；而含水量過高，導致基質多孔性降低，減少了基質內氣體的體積和氣體交換，難以通風降溫。

圖6 初始含水量對固體發酵的影響

2.6 料層厚度對固態發酵的影響

為達到優質高產的目標，就一定要滿足好氧微生物對氧氣的需求量。三角瓶靜置培養的方式，其料層厚度——裝瓶量（按物料總干重計算）直接影響到基質的含氧量，培養基厚度適中時，不僅使發酵反應器得到最大的空間利用率，而且盡可能增加含氧量。由圖7可以看出，隨著裝瓶量的增加，所測得蛋白含量先增加后減少，在裝瓶量為15 g時達到最大值29.454%。

圖7 裝瓶量對蛋白含量的影響

2.7 發酵時間對固態發酵的影響

在30℃恒溫培養箱中分別培養2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，測其蛋白質含量，確定最佳發酵時間。

由圖8可知，在發酵初期時，粗蛋白含量提高明顯，5 d之后蛋白含量積累較少。因為微生物在生長過程中要經歷遲緩期、對數生長期、穩定生長期和衰亡期，菌種在協同發酵過程中，發酵后期到達衰亡期，其發酵能力大大下降。所以，確定最佳發酵時間為5 d。

圖8 發酵時間對蛋白含量的影響

2.8 發酵溫度對固態發酵的影響

溫度可以充分影響微生物內酶的活性，進而影響微生物的生長。在確定最適酶處理方式、初始p H值、最佳發酵時間、初始含水量、最佳糟麩比、料層厚度和發酵時間的基礎上，分別在25℃、30℃、35℃恒溫培養箱中培養，測其蛋白質含量，以確定最佳培養溫度。

由圖9可知，白地霉和假絲酵母混菌發酵的最適溫度為30℃。溫度過低，蛋白含量不高，這是由于溫度低，微生物體內的酶活力較低，微生物生長繁殖慢，隨著溫度升高，細胞內參與生命活動的酶反應速度加快，代謝和生長也相應加快，所積累的蛋白含量高；但溫度過高，蛋白含量亦不高，這是由于微生物體內的活性物質（如蛋白質、核酸等）失活，細胞功能下降，甚至死亡。

圖9 培養溫度對固體發酵的影響

2.9 正交試驗

對單因素發酵溫度、發酵時間、發酵厚度設計4因素3水平的正交試驗（表4），以確定最佳的發酵條件。通過方差分析（表5），可以得到3個因素對發酵所積累蛋白含量的影響大小為：發酵時間＞發酵溫度＞初始含水量＞料層厚度。蛋白含量最高的實驗小組為第六組，即發酵時間為120 h，發酵溫度為30℃，初始含水量為70%，料層厚度為5 c m（即12 g）。

表4 正交試驗

表5 方差分析

3 結論

通過單因素試驗確定初步發酵條件，在此基礎上，進行正交試驗，得出結論：發酵培養基糟麩比為9∶1、初始含水量為70%、料層厚度為5 c m、p H值為5.0，滅菌后，添加5%的纖維素酶在50℃預處理12 h，再接種1∶1的白地霉和假絲酵母（10%），30℃培養120 h，可以混菌固態發酵生產酒糟飼料蛋白含量達到30.094 8%。試驗對培養基無機鹽組成及含量未進行探討分析，以后的試驗還會探究。

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