一種適合油棕不同組織RNA提取的方法

李靜+王永+楊耀東+雷新濤+肖勇+夏薇

摘 要 獲得高質(zhì)量的RNA是開展油棕果實(shí)發(fā)育相關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究的重要前提和保障。以油棕成熟果肉、胚乳、胚和胚芽4種組織為材料，分別采用Invitrogen公司的Trizol試劑和MRIP法提取總RNA，并比較其提取效果。結(jié)果表明：MRIP法提取的RNA質(zhì)量較好，其中胚芽中的總RNA提取量高達(dá)2 139.0 ng/μL，而胚乳中的含量相比較低，僅為1 083.6 ng/μL；MRIP法的總體提取效果優(yōu)于Trizol試劑，包括RNA完整性、含量、純度等，適用于油棕及棕櫚科植物總RNA提取。

關(guān)鍵詞 油棕 ；果實(shí) ；RNA ；提取

分類號(hào) S564+.6

A Suitable Method of RNA Extraction from Different Oil Palm Tissues

LI Jing WANG Yong YANG Yaodong LEI Xintao XIAO Yong XIA Wei

（Coconut Research Institute / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， CATAS，

Wenchang， Hainan 571339）

Abstract High quality of RNA is the important prerequisite and guarantee to basic research related to oil palm fruit development in molecular biology. RNA extracting effects of both Trizol reagents and MRIP （Methods for RNA Isolation from Palms） method developed by our laboratory previously were compared among four oil palm tissues， i.e. mature mesocarp， endosperm， embryo and germinated plumule. MRIP can get good quality RNA.The RNA content of plumule is as high as 2 139.0 ng/μL， while that of endosperm is only 1 083.6 ng/μL. MRIP is generally better than Trizol method in respect of the integrality， content and purity of extracted RNA， which Suitable for oil palm and palm plants RNA extraction.

Keywords Oil palm ； Fruit ； RNA ； Extraction

果實(shí)發(fā)育特性研究是油棕種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)及品種改良的重要環(huán)節(jié)，而油棕果實(shí)含有大量的色素、油脂、多糖、多酚等成分，尤其是成熟果肉和種子胚乳中均含約50%的脂肪酸，其RNA提取難度較大。而純度高、完整性好、無DNA或其他雜質(zhì)污染的RNA是cDNA文庫(kù)構(gòu)建、基因克隆、Northern雜交和mRNA差異顯示等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前提取植物RNA的方法有很多，如CTAB法、Trizol法等，針對(duì)植物材料的不同，提取方法也不同，有的側(cè)重清除多糖、多酚的污染，有的側(cè)重清除水溶性化合物與RNA的共沉淀[1]。其中Invitrogen公司的Trizol試劑在快速提取植物RNA方面應(yīng)用廣泛，在擬南芥[2-4]等植物組織中的提取效果也相對(duì)較好。對(duì)于油棕等生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)的木本油料植物，其果實(shí)RNA提取不僅要考慮油脂、多糖、多酚等的影響，還要防止氧化降解。本研究以油棕成熟果肉、胚乳、胚和胚芽4種組織為材料，對(duì)比了Trizol試劑和本研究室創(chuàng)制的棕櫚科植物RNA提取方法（MRIP， Methods for RNA Isolation from Palms）[5]提取各組織總RNA的效果，以期篩選出快速、有效的提取油棕不同組織RNA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所油棕種質(zhì)圃中的4年生油棕樹。分別取成熟油棕果的果肉、胚乳、胚以及組織培養(yǎng)15 d的胚芽等4種組織，新鮮樣品用液氮速凍備用。

相關(guān)塑料制品均用0.1% DEPC水溶液浸泡10 h以上并經(jīng)高溫高壓滅菌，玻璃、陶瓷及金屬制品均以200℃高溫烘烤8 h以上，以保證無RNAase污染。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取方法

分別采用Invitrogen公司的Trizol試劑和MRIP法提取RNA。Trizol試劑提取法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。MRIP提取方法如下：稱取0.1 g樣品用液氮研磨至細(xì)粉末狀，加入到已含有1 mL裂解液的2 mL離心管中，震蕩混勻后，靜置10 min；加入200 μL氯仿，充分混勻后，靜置10 min；以4℃，10 000 r/min離心10 min；吸取上清液至新的1.5 mL離心管中，加等體積的冰異丙醇，顛倒混勻后，靜置10 min；以4℃，10 000 r/min離心10 min；去上清后加1 mL 70%的乙醇，放置10 min；以4℃，7 500 r/min離心5 min；去上清，用無菌風(fēng)吹5～10 min后，加入20 μL去RNA酶的無菌水，用槍頭吸打混勻后備用。

1.2.2 RNA檢測(cè)方法

采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA條帶的完整性：分別取5 μL的RNA與1 μL的溴酚藍(lán)混合后點(diǎn)樣，以120 V、80 A電泳20 min后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)；分別取1 μL樣品用NanoDrop核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度。endprint

1.2.3 cDNA第一鏈合成

取MRIP法提取的果肉、胚乳、胚芽和胚的RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成，方法參照Fermentas的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。取5 μL的mRNA與1 μL的Oligo（dT）18混合后加入6 μL去RNA酶的無菌水，混合后于60℃下變性5 min，迅速置于冰水混合物中5 min；在混合液中加入4 μL buffer、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、2 μL 10 mmol/L的dNTP和1 μLRNA酶抑制劑，總體積為20 μL；于42℃ 放置1 h，72℃滅活5 min。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內(nèi)參基因PCR檢測(cè)

以內(nèi)參基因eIF為特異性引物，對(duì)果肉、胚乳、胚芽和胚等4種組織的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：eIF1F：5′CCTCACCTATACTCTTCCCACCA3′；eIF1R：5′GTCATCGCCCAGGCACAG3′。20 μL反應(yīng)體系中包含2 μL模版cDNA，2 μL 10×PCR Buffer，1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.4 μL dNTP MIX，0.4 μL Taq酶（5U/μL），其余體積用13.2 μL的滅菌 ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min； 94℃ 變性30 s，56℃ 復(fù)性30 s，72℃ 延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性

由圖1可以看出，Trizol法和MRIP提取的油棕不同組織RNA中，均是MRIP提取效果較好，條帶更亮，且28S基本沒有降解，其亮度約為18S的2倍，表明RNA的質(zhì)量好。而Trizol法所提取的RNA中，28S、18S條帶很弱，且5S條帶較亮，說明降解比較嚴(yán)重。胚和胚芽是幼嫩組織，其所含的RNA量更高，因此電泳條帶更亮，而胚乳中所含的總RNA的量較低。

2.2 RNA濃度和純度

由表1可見，雖然2種方法均可提取到不同組織的總RNA，但是MRIP法所提取的總RNA在濃度和質(zhì)量上明顯優(yōu)于Trizol法，且RNA得率幾乎是Trizol的2倍。其中胚芽中所提取到的RNA濃度更高，可達(dá)到2 139.0 ng/μL；其次是胚（2 086.1 ng/μL）；果肉中也較高（1 954.3 ng/μL）；胚乳中所含的總RNA濃度相對(duì)較低，僅為1 083.6 ng/μL。A260/280值是評(píng)價(jià)樣品純度的，其比值在1.8到2.0之間說明RNA的純度較高。采用MRIP法提取的總RNA A260/280值均在1.80以上，而采用Trizol法提取的總RNA A260/280均值不到1.8，表明Trizol法提取的RNA純度較低。以上結(jié)果表明MRIP法比Trizol法更適用于提取油棕各組織的總RNA，可以得到質(zhì)量及產(chǎn)量均更高的RNA樣品。

2.3 內(nèi)參基因擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)以內(nèi)參基因eIF特異引物對(duì)MRIP法所提取的4種油棕組織RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。獲得大小為250 bp的特異條帶。 由圖2可以看出，胚乳的擴(kuò)增條帶不太亮，可能是提取產(chǎn)量較低的緣故，但仍可滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求；其余3種組織的擴(kuò)增條帶清晰、邊緣整齊且亮度強(qiáng)，說明MRIP法提取的油棕果肉、胚芽和胚的RNA質(zhì)量完好并具有很好的生物活性，大可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

3 討論與結(jié)論

RNA提取是進(jìn)行基因表達(dá)、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、RNA-Seq等實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟，而完整的、純度較高的RNA是保證實(shí)驗(yàn)順利完成的主要因素。從油棕中提取高質(zhì)量的RNA是保證其分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵。本試驗(yàn)表明，用MRIP法提取油棕4種組織RNA比較快速，只需1.5～2 h。雖然Trizol法也比較快速，但是其提取效果與MRIP相比較差。此外雖然楊光華等[6]比較了SDS和CTAB法提取椰子葉片和根部的RNA的效果，發(fā)現(xiàn)CTAB法較SDS法更好一點(diǎn)，但是Xiao等[5]對(duì)比了CTAB法與MRIP法提取椰子等植物RNA的效果，發(fā)現(xiàn)MRIP法省時(shí)省力，且RNA的得率和純度都較高。在本研究中發(fā)現(xiàn)，采用MRIP法提取得到的油棕不同組織的RNA完整性好、純度高，表明此法比Trizol法和CTAB法更適用于提取油棕等棕櫚科植物的RNA。

目前提取植物RNA的方法有很多種。不同的植物（例如草本植物和木本植物）以及同一植物的不同組織，由于組織部位、發(fā)育成熟度等差異其內(nèi)含物組分及含量都有一定的差異[7]。葉片和果實(shí)的RNA提取方法也不相同，這主要是由于不同組織所含的多糖、多酚及碳水化合物不同，故提取方法的側(cè)重點(diǎn)也不一樣。例如張玲等[8]對(duì)比了6種RNA提取方法，最終發(fā)現(xiàn)CTAB氯化鋰法提取的RNA得率和純度更高。姚世響等[9]采用Invitrogen Trizol法提取的灰綠藜RNA完整性較好，經(jīng)mRNA純化后可成功用于抑制消減文庫(kù)的構(gòu)建。袁貞等[10]采用Trizol法提取了番木瓜果實(shí)總RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所提取的RNA完整性好，受多糖、多酚影響較小，且無DNA和蛋白質(zhì)污染。吳凱朝等[11]利用Trizol改良法提取了甘蔗、水稻、玉米等3種禾本科作物不同組織的RNA，提取效果良好。Trizol法雖然適用于提取以上物種RNA，卻不適用于椰子。Xiao等[5]對(duì)比了CTAB、天根的RNA植物提取試劑盒、Trizol試劑和MRIP等4種方法提取椰子葉片RNA的效果，發(fā)現(xiàn)MRIP法提取的葉片總RNA的純度和得率均優(yōu)于另外3種方法。在本實(shí)驗(yàn)中也得到同樣的結(jié)果，用MRIP法提取油棕果肉等各組織RNA的效果優(yōu)于Trizol法。說明MRIP法適用于提取椰子和油棕不同組織的RNA，這為以后提取檳榔、海棗、蒲葵等棕櫚科植物RNA提供參考。

本試驗(yàn)結(jié)果也存在不足之處，例如在表1中可以看到，MRIP法提取的RNA的A260/230值偏低，均在2以下。A230是多肽、芳香基團(tuán)、苯酚和一些碳?xì)浠衔锏奈舛龋筛鶕?jù)其值的大小判斷樣品中污染物存在的情況，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸A260/A230應(yīng)小于2.2大于2.0。一般A260/230小于2.0說明RNA樣品中可能存在其他干擾物質(zhì)（如萜類化合物等次生代謝物）；A260/230大于2.0說明RNA水解為單核酸。本試驗(yàn)所提取的不同組織RNA其A260/230均在2以下，說明其RNA樣品中還存在一定的干擾物質(zhì)；此外，從圖1中可以看到，點(diǎn)樣孔附近有亮帶，說明其含有多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。endprint

筆者分析了油棕各組織的成分，發(fā)現(xiàn)油棕胚乳、果肉、胚、胚芽中富含脂肪酸、多糖、多酚等物質(zhì)，這些物質(zhì)與RNA結(jié)合在一起，使結(jié)果很難得到完整純凈的RNA。Sangha等[12]采用改良CTAB法和二氧化硅過濾柱法，從富含脂肪酸、多糖、蛋白等的麻風(fēng)樹種子中提取得到完整的RNA，其A260/230達(dá)到1.91。孫德權(quán)等[13]對(duì)傳統(tǒng)的Trizol操作步驟進(jìn)行優(yōu)化，即加入10%的PVPP與材料共研磨，并在Trizol提取液中加入1% β-巰基乙醇，可以完全排除酚類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)的干擾。劉海等[14]通過在裂解液中加入聚乙烯吡咯烷酮去除多酚類化合物及利用水飽和乙醚去除多糖的方法，在香蕉果實(shí)中提取到了完整性較好的RNA。筆者認(rèn)為MRIP法應(yīng)該借鑒前人的研究成果，改進(jìn)裂解液的配方（例如添加抗氧化成分PVPP等），完善提取步驟，以便在棕櫚科植物不同組織中提取更完整、純度更高的RNA。

參考文獻(xiàn)

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筆者分析了油棕各組織的成分，發(fā)現(xiàn)油棕胚乳、果肉、胚、胚芽中富含脂肪酸、多糖、多酚等物質(zhì)，這些物質(zhì)與RNA結(jié)合在一起，使結(jié)果很難得到完整純凈的RNA。Sangha等[12]采用改良CTAB法和二氧化硅過濾柱法，從富含脂肪酸、多糖、蛋白等的麻風(fēng)樹種子中提取得到完整的RNA，其A260/230達(dá)到1.91。孫德權(quán)等[13]對(duì)傳統(tǒng)的Trizol操作步驟進(jìn)行優(yōu)化，即加入10%的PVPP與材料共研磨，并在Trizol提取液中加入1% β-巰基乙醇，可以完全排除酚類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)的干擾。劉海等[14]通過在裂解液中加入聚乙烯吡咯烷酮去除多酚類化合物及利用水飽和乙醚去除多糖的方法，在香蕉果實(shí)中提取到了完整性較好的RNA。筆者認(rèn)為MRIP法應(yīng)該借鑒前人的研究成果，改進(jìn)裂解液的配方（例如添加抗氧化成分PVPP等），完善提取步驟，以便在棕櫚科植物不同組織中提取更完整、純度更高的RNA。

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