脂質體作為疫苗佐劑的研究進展

王禮燕 郭亞東 魯衛東

昆明醫科大學藥學院，云南 昆明 650500

1 免疫佐劑

1.1 免疫佐劑的概述 在免疫學中，佐劑 (adjuvant)是指能夠增強或調節抗原體液或細胞免疫應答的物質。佐劑在有限抗原數量時有助于誘導早期的、較強的和長時間的免疫應答。成為純化疫苗，亞單位疫苗和DNA疫苗研究的焦點，這些疫苗的免疫原性較弱，需要佐劑來激活免疫應答[1-4]。隨著免疫學研究的不斷深入和基因工程技術的迅速發展，基于對免疫效果和生產使用成本降低的追求，佐劑的研究在現代免疫學中顯得越來越重要。通過提高佐劑的效果，達到減少抗原用量，降低對機體的毒副作用，是理想佐劑的一個重要標志。

1.2 疫苗佐劑的研究現狀 2009年以前，鋁佐劑是美國FDA唯一認可用于人用疫苗的佐劑。但由于鋁佐劑疫苗引發不夠理想的Th1免疫應答以及較弱的細胞免疫，并且，以鋁化合物為佐劑的疫苗無法冷凍保存，限制了鋁佐劑在疫苗使用中的廣泛性，因而尋找替代佐劑迫在眉睫[5]。在所有替代佐劑的研究中，脂質體是最具發展前景的一種。1974年，Gregoriadis和Allison首次報道了脂質體作為免疫佐劑的應用[6-7]。從此，脂質體以及相關的泡囊載體作為高效的誘導體液及細胞免疫的佐劑廣泛用于感染性疾病及癌癥疫苗中[8-10]。目前，至少有8種脂質體佐劑疫苗系統被批準用于人用或在進行臨床實驗[5]。其中，瑞士Crucell的流感疫苗Inflexal V及甲型肝炎疫苗Epaxal是目前上市的唯一兩種脂質體佐劑疫苗。

2 脂質體

2.1 脂質體的形態 脂質體 (liposome)自1960年由英國學者Bangham首次制得，系指將藥物包封于類脂質雙分子層形成的薄膜中間所制成的超微型球狀藥物載體制劑。是由脂質雙分子層組成的、內部為水相的閉合囊泡，具有生物膜的功能和特性，如圖1，圖2。

脂質體主要是由磷脂及其它附加劑組成，磷脂在脂質體中形成雙分子層，其它附加劑起到提高脂質體的穩定性和靶向性等作用。由于脂質體包封材料的特殊性，具有很多優點，如:生物相容性，靶向性，緩釋性，增加藥物的穩定性等。

2.2 脂質體的制備方式 傳統的薄膜蒸發法是脂質體制備方法中最基本和應用最廣泛的方法[11]，本法簡單，易操作，適合實驗室研究。流感病毒是囊膜病毒，對乙醚，氯仿等有機溶劑均敏感。用薄膜蒸發被動載藥法制備流感疫苗脂質體，它避免了疫苗與有機溶劑的直接接觸。主要存在的問題是工藝的不完善、有機溶劑或表面活性劑的殘留都會導致蛋白質藥物的生物活性降低，而且難以實現大批量脂質體的制備[12]。

2.3 脂質體理化性質對其免疫原性影響 對脂質體的主要理化性質對脂質體流感疫苗免疫原性的影響從機制上進行系統的研究，為脂質體作為流感疫苗佐劑的應用奠定理論基礎。經過35年以及超過1300個研究，很明顯脂質體理化性質對其免疫原性影響極為重要。對免疫原性影響較大的包括:

2.3.1 抗原的包被方式。決定抗原釋放速度以及被APC識別的難易[13]。

2.3.2 脂質體組成、電荷、粒徑等。能改變脂質體藥動學性質從而獲得理想的停留和抗原攝取、處理以及遞呈在MHC分子[14-15]。Mann等研究發現，小粒徑脂質體刺激較強烈的Th2應答，大徑粒刺激的Th1應答較強 (IFN-r及IgG2水平較高)，并能刺激較強的保護性抗體[16]。粒徑大小對抗原向淋巴結的轉運、攝取、加工也至關重要[17]。大顆粒易被DC攝取，小顆粒向淋巴結轉運，被MP和DC攝取。提示攝取部位與顆粒大小有關。小顆粒易到達淋巴結，誘導IgG2抗體、B細胞核CD8+T細胞免疫應答[18]。帶正電荷脂質體通過與帶負電的細胞膜形成電子對復合物降低細胞膜的穩定性，使抗原能更有效地傳遞到細胞質。大顆粒、正電荷脂質體被APC吞噬作用強[19]。另外，與陰離子脂質體相比，陽離子脂質體更易促進DC成熟水平 (由CD83表達)，從而增加DC吞噬作用。大粒徑、陽離子脂質體會通過增加抗原在給藥部位的停留，促進DC成熟，從而增強T細胞免疫應答[20]。陽離子脂質體本身有佐劑效應，可以激活APC。陽離子脂質體某些成分可能能誘導炎性細胞因子的釋放，導致Th1型的免疫反應，從而增加APC對抗原的攝取[21-22]。脂質膜流動性可通過使用具有不同相變溫度的脂質材料來調節。研究發現，使用具有較高相變溫度的脂質材料有利于激發更強的抗體應答[23]。另外，脂質體的結構對其包被的抗原的免疫作用也會產生影響，單室脂質體激發IgG是同劑量多室脂質體的2倍[24]。脂質體的剛性在促進免疫增強上也有影響。Barouche等研究發現[25]，僅有DSPC的GCSA不激發免疫應答，加入膽固醇增加脂質膜剛性后免疫應答作用增強。Barouche等研究還發現，剛性增強及相變溫度升高可刺激機體產生較高的抗體及細胞免疫。

3 脂質體疫苗的研究進展

脂質體疫苗的研究于近10年非常熱門，1974至2010年，根據Pubmed統計，有1316個相關的研究報道，其中一半在近8年[26]。與其它疫苗佐劑相比，脂質體作為疫苗佐劑有很多獨到之處:

3.1 安全、耐受 已批準使用的Inflexal V目前已在43個國家使用超過六千萬例，其安全性與耐受性已得到很好證實，此外，目前正在進行的幾個脂質體疫苗的臨床使用也證實了具有可接受的低基因反應[27]。另外，由于脂質體是由一些類細胞膜材料組成，因而可以完全生物降解。

3.2 廣泛性 脂質體組成以及脂質體制備方法能定制，以達到特定要求的脂質體理化性質[28]。親水性抗原可包裹于親水區域或螯合在脂質體表面，親脂性抗原包于親脂空間，這使得幾乎所有性質的抗原 (包括蛋白質、多肽、碳氫化合物、核酸以及小分子半抗原等)，在通過對脂質體理化性質進行適當的調節以適應抗原不同分子量大小及電荷，均可被包封，因而得到了廣泛的應用。

3.3 靶向性 抗原能否準確靶向抗原呈遞細胞上特定的受體 (如DC上的DC-SIGN)也極為重要[29-30]。在脂質材料中加入免疫調節劑，如TLR激動劑或其它的PRR激動劑等，能增強特定受體的靶向性。此外，由于脂質體的包封以及微粒結構，不僅保護抗原不被降解，而且促進巨噬細胞攝取疫苗抗原[31]。

3.4 緩釋性 可延長抗原或半抗原的作用時間，協助抗原或半抗原誘導體液免疫和/或細胞免疫。

3.5 可冷凍干燥 經研究，以脂質體為佐劑的疫苗抗原，凍干后與凍干前相比，其物理性狀及免疫原性均無太大差別。這為減輕脂質體疫苗產品冷鏈運輸的壓力奠定了基礎。

4 展望

以上是近35年研究比較集中的脂質體理化性質，它們對免疫原性的影響涉及到其包被的抗原的攝取、轉運、處理以及呈遞的各個環節。然而由于各理化性質之間相互作用，脂質體理化性質與免疫原性二者之間的關系很難界定[26]。另外，由于不同研究中使用的脂質體組成、抗原種類、免疫途徑、抗原用量及實驗動物種類的不同，使得二者之間的關系沒有統一可用的標準。

此外，還應注意到，佐劑與不同的抗原合用，其非特異性免疫調節作用是不可預知的，因而佐劑的批準是與特定的抗原綁定，而不是作為單獨的佐劑。所以單純脂質體作為佐劑的作用機理不可能得到全面的詮釋，也沒有太大的研究價值，除非與特定的抗原綁定在一起研究。此外免疫途徑、抗原用量對特定脂質體疫苗免疫原性也有極大影響。

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