HPLC法測定喉咽清口服液中齊墩果酸的含量

謝 誼 李躍輝 唐純玉 唐代鳳 劉玉琴，3 曹立云 彭艷梅

1.湖南省中醫藥研究院楊永華名老中醫藥專家傳承工作室，湖南長沙 410013；2.湖南時代陽光藥業股份有限公司，湖南永州 425000；3.湖南中醫藥大學，湖南長沙 410208

喉咽清口服液是由土牛膝、馬蘭草、車前草、天名精四味中藥提取制成的中藥口服液，為湖南時代陽光藥業股份有限公司自主研制開發的國家級新藥，是全國獨家產品，其中土牛膝為該制劑的君藥，別名倒扣草，收載于《湖南省中藥材標準》2009年版，為覓科植物土牛膝Achyranthes aspera Linnaeus的干燥根及根莖，性平、微苦、涼，具清熱解毒、利咽化痰、抗菌消炎、鎮靜止痛之功效，臨床常用于白喉、扁桃體炎、急慢性咽喉炎、感冒發燒、麻疹肺炎、癰疽癤腫、蛇咬傷、類風濕關節炎等的治療[1-4]。據文獻報道，喉炎清口服液聯合利巴韋林氣霧劑治療兒童急性咽炎效果顯著[5]。土牛膝所含化學成分主要為三萜皂苷（苷元為齊墩果酸，如齊墩果酸吡喃鼠李糖基吡喃半乳糖苷、齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、生物堿（如甜菜堿）、昆蟲變態激素（如β-蛻皮甾酮）以及多糖[6]。制劑收載于《中國藥典》2010年版一部，含量測定采用雙波長薄層色譜掃描的方法，測定土牛膝水解后得到的齊墩果酸的含量，該方法專屬性不好，操作復雜。本研究擬用HPLC法測定齊墩果酸的含量，為該制劑的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD－10AVP紫外可見檢測器，島津Cs-930型雙波長薄層掃描儀（日本島津公司）；N2000雙通道色譜工作站（浙江大學智能信息工程研究所）；定量毛細管（美國Drunmand公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HH系列恒溫水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠）。

1.2 對照品與試藥

齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：111733-201205，供含量測定用）；喉咽清口服液由企業提供（批號分別為20120922、20121005、20121015、20121113、20130117、20130401、20130412、20130620、20130660、20130901）。

1.3 試劑

硅膠G（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈為色譜純；濃鹽酸、硫酸為分析純；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

精密量取喉咽清口服液25 mL至50 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，冰箱放置3 h后取出，放至室溫，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL、鹽酸3 mL，置錐形瓶中加熱回流 1 h，冷卻，轉移至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）振搖提取6次，每次20 mL，合并石油醚液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解，定量轉移至10 mL量瓶中，冷卻，加甲醇至刻度，搖勻，濾膜過濾，取續濾液即得[7]。

2.2 對照品溶液的制備

取齊墩果酸對照品9.86 mg，精密稱定，置于10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸對照品儲備液，濃度為0.986 mg/mL。精密吸取上述對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成濃度為0.493 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.3 陰性干擾試驗

取除土牛膝外的其他藥材，按工藝方法制備，并按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件與系統適應性[8-9]

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（90∶10）；紫外檢測波長：210 nm[10]；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。 按齊墩果酸峰計算，理論板數應不低于2000。

此條件下待測組分與其他組分達到有效分離；陰性無干擾。對照品、喉咽清口服液供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.5 線性關系的考察

精密吸取齊墩果酸對照品儲備液（0.986 mg/mL）1、2、4、6、8、10 μL，按照前述色譜條件分別進樣測定，記錄各進樣量下的色譜峰面積，以峰面積積分值Y對進樣量X（μg）進行線性回歸，得齊墩果酸的線性回歸方程為：Y=2.42×103X+5.31×104，r=0.9997，齊墩果酸在0.986～9.860 μg線性范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖1 各溶液高效液相色譜圖

2.6 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液（批號：20130620），按照前述色譜條件，連續進樣6次測定，記錄各次峰面積。結果得齊墩果酸峰面積的RSD為0.96%，表明本方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取同一批號樣品（批號：20130620），按照“2.1”項下操作制備供試品溶液，按照前述色譜條件，分別于0、2、4、8、10 h 精密吸取該供試品溶液 10 μL 進樣測定，記錄各次峰面積，計算得齊墩果酸峰面積的RSD為0.44%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.8 重復性試驗

取同一批號樣品（批號：20130620）6 份，按照“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取各份溶液10 μL，注入液相色譜儀，按外標法計算齊墩果酸的含量。6份樣品中齊墩果酸的平均含量為0.242 mg/mL，RSD為1.92%，表明方法的重復性良好。

2.9 加樣回收試驗

精密量取已知含量的同一批號（批號：20130620）樣品6份，每份10 mL，醇沉準備酸水解時，再精密加入齊墩果酸對照品適量，按照“2.2”項下操作分別平行制備6份供試品溶液。精密吸取各溶液10 μL，按照前述色譜條件分別進樣測定，記錄色譜峰面積，計算回收率，結果見表1。

表1 齊墩果酸加樣回收率試驗（n=6）

2.10 樣品測定

取10樣品進行含量測定，按“2.1”項下操作，進樣，計算齊墩果酸的含量，結果見表2。

表2 10批喉咽清口服液中齊墩果酸的含量測定結果（mg/mL，n=2）

2.11 薄層掃描色譜法[11]

2.11.1 色譜條件 展開劑為環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（20∶5∶8）；顯色劑為 10%硫酸乙醇溶液；掃描波長λS=520 nm，λR=700 nm。

2.11.2 供試品溶液的制備 精密量取本品25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取6次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇30 mL、鹽酸3 mL使溶解，加熱回流提取1 h，提取液回收乙醇至無醇味，加水30 mL，用石油醚（60～90℃）振搖提取 6次，每次20 mL，合并石油醚液，置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇微熱使溶解，定量轉移至5 mL量瓶中，冷卻，加無水乙醇刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.11.3 對照品溶液的制備 方法與“2.2”項下同。

2.11.4 線性關系考察 精密吸取齊墩果酸對照品儲備液（0.986 mg/mL）2、4、6、8、10 μL 點于同一硅膠 G 薄層板上，展開，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，晾干，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，按照上述色譜條件進行掃描，測定峰面積積分值。以齊墩果酸含量X（μg）為橫坐標，以吸收度積分值Y為縱坐標，計算回歸方程Y＝4572.1X-508.7，r＝ 0.9991，線性范圍為：1.97～9.86 μg。

2.11.5 樣品測定 分別吸取各供試品溶液3、6 μL、對照品溶液2、4 μL，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，展開、掃描，測量供試品與對照品吸收度積分值，測定，計算，即得。色譜圖見圖2。

圖2 齊墩果酸薄層色譜掃描圖

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇

原標準是采用正丁醇振搖提取口服液中的齊墩果烷類三萜皂苷成分，操作繁瑣，而且冬天氣溫低，樣品溶液容易乳化難以分層，為操作帶來不便，本研究改為醇沉除去雜質保留有效成分，簡化了操作。考察了試驗過程中硫酸、鹽酸酸水解時間[12]，結果鹽酸水解1 h較完全。

3.2 流動相的篩選

本實驗對甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水這三種流動相系統進行了比較篩選，結果發現以甲醇-水系統無論怎樣調節兩者比例均未得良好峰形的峰，而換用乙腈-水流動相即可得到滿意的色譜峰形，齊墩果酸與其他雜質峰的分離度也較高。

3.3 紫外測定波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在190～380 nm范圍內分別掃描齊墩果酸峰的紫外吸收，齊墩果酸在204 nm波長處有最大吸收，但由于甲醇的截止波長為205 nm，選用此波長來檢測時溶劑有吸收，對測定造成干擾，故選用210 nm作為測定波長，以保證測定結果的準確性。

3.4 樣品含量結果分析

采用高效液相色譜法和薄層掃描法兩種方法，對企業提供的10批喉咽清口服液進行齊墩果酸含量測定，結果同一廠家不同批次間的含量差異不明顯，但是兩種方法測定的結果差異很大。《中國藥典》（2010年版）采用雙波長薄層色譜掃描的方法，測定口服液中土牛膝水解后得到的齊墩果酸的含量，薄層掃描方法專屬性不好，結果可受薄層板吸附劑的性能及薄層質量、斑點分離情況、顯色情況等多種因素的影響[13-15]，測定結果的重復性不是很好；齊墩果酸在加入顯色劑后，要盡可能在半小時內測定，以免誤差大[12]。而本文建立了RP-HPLC測定喉咽清口服液中齊墩果酸含量的方法，操作簡便，測定結果準確，方法重復性好，可作為喉咽清口服液質量控制的有效方法。

[1]萬勝利，聶平，孫輝，等.HPLC法測定喉咽清口服液中齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量[J].中國藥師，2013，16（6）：828-830.

[2]歐麗蘭，余昕，朱燁，等.土牛膝在急性炎癥動物模型中的抗炎作用[J].華西藥學雜志，2012，27（6）：644-646.

[3]李偉平，何良艷，馬哲龍，等.土牛膝多糖抗炎鎮痛作用的研究[J].中華中醫藥學刊，2012，30（4）：747-749.

[4]饒芳，李榮群，傅華洲，等.土牛膝治療急性咽喉炎的實驗研究[J].現代中西醫結合雜志，2009，18（33）：4073-4074.

[5]寧來忠.喉咽清口服液聯合利巴韋林氣霧劑治療兒童急性咽炎療效觀察[J].世界臨床藥物，2013，34（10）：593-596.

[6]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].2版.上海：上海科學技術出版社，2005：114.

[7]黃志芳，黃志紅，胡吉林，等.土牛膝中齊墩果酸、牛膝多糖的提取與鑒別[J].中國實用醫藥，2010，5（17）：6-7.

[8]李全斌，何開勇.齊墩果酸含量測定的研究進展[J].中國執業藥師，2011，8（7）：32-34.

[9]歐麗蘭，稅丕先，莊元春，等.高效液相色譜法測定川產土牛膝中齊墩果酸的含量[J].現代醫藥衛生，2011，27（6）：806-807.

[10]相延英，楊光.常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測定[J].中國醫院藥學雜志，2004，24（5）：316-318.

[11]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1159.

[12]彭玲芳，夏偉軍，崔濤.密脈鵝掌柴提取物中總皂苷及齊墩果酸的含量測定[J].中國藥師，2012，15（11）：1551-1553

[13]何麗一.薄層色譜法及影響定量的因素[J].色譜，1987，5（5）：292-297.

[14]羅朵生，郭姣，何偉等.高效液相色譜法與薄層掃描法測定女貞子中齊墩果酸含量的比較[J].時珍國醫國藥，2008，19（6）：1411-1412.

[15]張玉娥，李獻州.高效液相色譜法與薄層掃描法測定女貞子中齊墩果酸含量的比較[J].中成藥，1999，21（4）：205-207.