評價肺炎鏈球菌疫苗免疫效果的功能性抗體檢測方法的建立

李江姣 杜慧竟 石繼春 徐 苗 葉 強

中國食品藥品檢定研究院衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 100050

肺炎鏈球菌可以引起肺炎、菌血癥、腦膜炎、中耳炎等疾病，是兒童和老年人獲得性感染的主要病原菌[1]；接種肺炎鏈球菌疫苗可以有效預防肺炎鏈球菌感染[2]。為了保證疫苗質量，所有肺炎鏈球菌疫苗上市前均需對其免疫保護效力進行測定。目前針對該疫苗，普遍采用的體外效力檢測方法是酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用抗原-抗體的特異性結合特性對待測血清中的抗體水平進行檢測[3]；但該類方法只能檢測抗體的總含量，無法將功能性抗體甄別出來，不能真實反映疫苗的免疫保護效果。事實上，對于一些特殊人群，如老年人和免疫系統不完善的人群，接種疫苗后產生的抗體往往是非功能性抗體，不能發揮免疫保護作用[4-5]。可見，如果單純以抗體含量來評估疫苗質量，很可能無法準確鑒定疫苗的保護效力。因此，迫切需要建立能夠準確反映功能性抗體含量的檢定方法，以便能夠正確評估肺炎鏈球菌疫苗的保護效力和質量。

肺炎球菌疫苗的保護機制主要是通過特異性抗體介導的調理吞噬作用將體內的肺炎球菌清除。所謂調理吞噬作用是指抗體、補體與吞噬細胞表面結合，促進吞噬細胞吞噬細菌等顆粒性抗原的作用。由此可見，注射疫苗后只有機體產生能夠有效介導調理吞噬作用的功能性抗體，才能發揮真正的免疫保護作用。通過體外調理吞噬實驗 （opsonophagocytic assay，OPA）檢測抗體的調理吞噬活性，能夠直接反映功能性抗體含量，實現對疫苗保護效力的準確評估[6]。已有多項研究表明，OPA與疫苗臨床有效性的相關性要高于ELISA[7-8]。

近年來，國際上多個實驗室開始致力于OPA技術的研發，試圖建立一套穩定、可靠、標準化的檢測方法。美國阿拉巴馬大學通過長期探索，建立了優化的多重調理吞噬實驗（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時對4種血清型的肺炎球菌功能抗體進行檢測，簡化了實驗流程，減少了工作量并節約血清樣本，提高了OPA技術的檢測通量[9]。并且國外部分藥企已經開始采用OPA方法進行肺炎鏈球菌疫苗的臨床效力評價[8，10-11]。但由于該方法操作較為復雜，技術要求高，目前國內該方法的研究和應用比較缺乏。本研究參考美國阿拉巴馬大學大學的MOPA實驗，結合國內的實際情況，旨在建立一套適合我國應用的肺炎鏈球菌疫苗效力評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HL-60 細胞系購自美國 ATCC（CCL-240）；13 個血清型的肺炎鏈球菌菌株（帶有特定抗生素抗性）來源于美國阿拉巴馬大學伯明翰分校Moon H Nahm實驗室；5份血清樣本來源于23價肺炎球菌多糖疫苗免疫后的健康人群；SPF級新西蘭乳兔（3～4周齡）由中國食品藥品檢定研究院衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室提供。

1.2 試劑

BactoTMTodd Hewitt Broth （THB）（批號：3071477）、酵母提取物（批號：2220095）購自BectonDickinson公司；RPMI1640（批號：1393807）、胎牛血清（批號：1428479）購自 Gibco公司； 二甲基甲酰胺 （DMF）（批號：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（批號：2532B313）購自 Amresco公司；Anti-CD11b PE（批號：2184659）、Anti-CD35PE（批號：2326940）、Anti-CD71 PE（批號：2292633）、Annexin V FITC（批號：2202518）、Propodium Iodide（PI）（批號：SLBB4626V）和 Annexin V Binging Buffer（批號：30435）購自 BD Pharmingen 公司；4 種抗生素：奧普脫欣（Optochin，批號：051M1257V）、奇霉素（Spectinomycin，批號：102K05447V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBC9232V）、鏈霉素（Streptomycin，批號：2036B318）購于 Sigma 公司。

1.3 儀器

菌落計數器（型號：ProtoCOL 3）購自英國Synbiosis公司；流式細胞儀（型號：FACS Calibur）購自美國BD公司。

1.4 HL-60細胞的培養及主代細胞庫的建立

從ATCC購買的原始HL-60細胞經復蘇、增殖培養、再凍存建立一個主代細胞庫（80管）。

1.5 HL-60細胞的分化及鑒定

使用DMF誘導HL-60細胞分化5 d，用流式細胞儀進行檢測。具體分化步驟及鑒定方法參考文獻[12]。

1.6 肺炎鏈球菌工作種子批的制備及鑒定

1.6.1 肺炎鏈球菌工作種子批的制備 來源于美國阿拉巴馬大學的各型肺炎鏈球菌，37℃培養過夜后轉移至THY液體培養基中繼續培養至OD600為0.6～0.9，收集培養液加80%甘油混勻后分裝凍存，制備工作種子批。

1.6.2 凍存菌種活力檢測 將凍存菌種與未經冷凍的細菌同步稀釋后，37℃過夜培養后進行菌落計數，計算冷凍細菌的復活率。

1.6.3 凍存細菌抗生素抗性及敏感性檢測 在分別含4種抗生素（奧普脫欣、奇霉素、鏈霉素、甲氧芐氨嘧啶）的培養基和不加抗生素的對照培養基中，劃線接種13個型的肺炎鏈球菌，37℃培養過夜后進行觀察。

1.6.4 凍存細菌工作稀釋度的確定 按照參考文獻[12]的方法進行工作稀釋度的測定。選擇菌落數為80～120 cfu/spot的稀釋度作為最佳稀釋度。

1.7 補體制備及鑒定

取SPF級新西蘭乳兔頸動脈采血獲得補體，按照文獻[12]的方法測定該批次補體的非特異性殺菌率。

1.8 調理吞噬試驗

將待測血清在56℃水浴中滅活30 min，按照參考文獻[12]的方法進行操作。經菌落計數后，用軟件Opsotiter3計算樣本的調理吞噬滴度。

2 結果

2.1 HL-60細胞的表面標志鑒定和活力測定

經測定，未分化的HL-60細胞表面標志表達量：CD35為 7.03%，CD71為 88.87%，活細胞比例為88.89%（圖1）。HL-60細胞在誘導分化5 d后表面標志表達量：CD35為71.78%，CD71為10.97%，活細胞比例為72.96%（圖2）。阿拉巴馬大學參考方法的標準規定，分化后活性細胞比例應≥65%，CD35表達應≥55%，CD71表達應≤20%。本實驗測得的各項指標均符合阿拉巴馬大學參考方法的各項質量標準，可用作OPA實驗的效應細胞。

圖1 未分化HL-60細胞表面標志表達量及細胞活力檢測

圖2 HL-60細胞分化后表面標志表達量及細胞活力檢測

2.2 肺炎鏈球菌工作菌種的鑒定

2.2.1 凍存工作種子的復活率 結果顯示，13個血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的復活率分別為：1型94%，3型 92%，4型 96%，5型 95%，6A 型 94%，6B型 93%，7F型 91%，9V 型 93%，14型 94%，18C型94%，19A型95%，19F型96%，23F型95%，均高于90%。

2.2.2 工作菌種的抗生素抗性與敏感性檢測 結果顯示，各型工作菌種均只具有其特定的抗生素抗性，對其余3種抗生素均為敏感。見圖3。

2.2.3 工作菌種的工作稀釋度確定 13個血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的稀釋倍數分別為：1型3333×，3 型 6250×，4 型 2000×，5 型 16666×，6A 型6250×，6B 型 3030×，7F 型 6666×，9V 型 1250×，14 型1250×，18C 型 1470×，19A 型 10000×，19F 型 6250×，23F型6250×，均符合阿拉巴馬大學標準中稀釋倍數應≥1000的要求。每個血清型對應的稀釋條件下，存活的細菌數為80～120 cfu/spot。

圖3 肺炎球菌工作菌種的抗生素抗性及敏感性鑒定

2.3 補體的非特異性殺菌率

經計算，制備的補體非特異性殺菌率：1型為7%，3型為9%，4型為35%，5型為1%，6A型為58%，6B型為57%，7F型為12%，9V型為36%，14型為35%，18C型為1%，19A型為5%，19F型為 4%，23F型為47%。符合阿拉巴馬大學標準中非特異性殺菌率應≤70%的質量標準。

2.4 血清樣本的調理吞噬指數檢測

2.4.1 殺菌曲線 5份血清樣本的殺菌曲線見圖4。圖中可見，各血清樣本針對各型肺炎球菌的殺菌曲線均為標準的S型曲線。

2.4.2 調理指數 經菌落計數及軟件Opsotiter 3的計算，各血清樣本的調理指數結果見表1。

3 討論

圖4 5份血清樣本針對各型肺炎球菌的殺菌曲線

OPA實驗中涉及四個主要元素：效應細胞、靶菌、補體及抗體血清，缺一不可，對于試驗的成敗都非常重要。本試驗中，效應細胞選用的是HL-60細胞株（人早幼粒白血病細胞）。通過懸浮培養，HL-60細胞能持續增殖，人為誘導后可以分化為成熟的中性粒細胞，具有吞噬能力[13]。HL-60細胞在未分化和分化后表面標志物的表達情況會發生變化，如CD71和CD35。CD71蛋白在細胞增殖中發揮重要作用，其表達情況可以指示細胞的增殖狀態；CD35是一種跨膜的補體結合蛋白，存在于成熟的粒細胞表面，其表達情況可以顯示細胞的分化程度。HL-60細胞未分化之前，CD71的表達量較高，細胞具有較強的增殖能力；分化后CD71的表達量降低，細胞增殖能力減弱，CD35的表達量升高，細胞進入分化后的成熟粒細胞狀態。利用流式細胞儀對細胞表面標志物的表達情況進行監測，可以實現對細胞分化程度的判斷。HL-60細胞的活性及分化程度越高，吞噬能力越強。

MOPA實驗中的靶菌，是帶有特定抗生素抗性的各型肺炎鏈球菌。將靶菌按抗性不同進行分組，每組中的4種靶菌分別攜帶不同的抗性。利用這一特點，可同時對4種血清型的肺炎球菌進行功能抗體檢測。制備工作菌種后，對各型菌種的特定抗生素抗性及敏感性進行確認非常重要。此外，為了保證試驗數據的準確性，需要確保對照孔中的活性細菌數在70～180 cfu范圍之內；因此對工作菌種的凍存活力及工作稀釋度的核實也必不可少。

補體在OPA實驗中同樣處于重要地位。補體除了與型特異性抗體協作共同參與調理吞噬作用之外，其本身還具有一定的非特異性殺菌能力。如果補體自身的非特異性殺菌力太強，會使特定型別的靶菌被大量殺死，導致試驗失敗。因此試驗中需要先對補體的非特異性殺菌率進行測定，必要時需要對不同批次補體進行篩選。血清樣本在試驗前需要進行滅活補體的處理，還需要檢測是否含有抗生素，從而排除對試驗的干擾。血清樣本恰當的預稀釋倍數十分關鍵，根據實際情況需要進行調整，如果預稀釋倍數太高，容易導致殺菌不徹底，影響試驗結果的準確性，而預稀釋倍數太低，則容易導致殺菌率太高，無法檢出具體的調理滴度。

本研究中，HL-60細胞檢測結果顯示，分化5 d后活細胞比例為72.96%，CD35的表達量為71.78%，CD71的表達量為10.97%，符合MOPA參考試驗的標準要求。工作菌種檢測結果顯示，工作菌種的凍存活力均高于90%，抗生素抗性與敏感性與預期結果一致，工作稀釋度均≥1000，符合標準要求。補體的檢測結果顯示，非特異性殺菌率均≤70%，符合要求。對5份血清樣本的檢測結果顯示，兩平行樣本孔間的差異<3倍，殺菌曲線均為標準的S型曲線，符合MOPA試驗各項要求。上述結果表明，本研究已經成功建立了MOPA檢測方法。

表1 5份血清樣本的OPA滴度

OPA技術在國際上已被多個大型制藥企業用來進行肺炎球菌疫苗的臨床免疫效果評價，WHO也已推薦使用OPA技術進行疫苗的功能性抗體檢測[14-15]，OPA技術的應用已然成為肺炎疫苗臨床評價領域的一個發展趨勢。本研究在中國食品藥品檢定研究院建立了基于MOPA技術的肺炎球菌疫苗功能抗體檢測方法，對于促進國內肺炎疫苗臨床評價水平的提高有重要意義。

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