β重型地中海貧血兒童NK細胞頻率及殺傷活性

鮑俊杰 鄒 勇 陳小紅 張白杜

1.廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科，廣東廣州 510180；2.中山大學附屬第三醫院輸血科，廣東廣州 510630

同種異體輸血可導致免疫功能抑制，一旦發生免疫抑制，人體更易受到細菌、病毒和腫瘤的侵襲，臨床上通常表現為術后較高的細菌感染發生率和惡性腫瘤復發率[1-3]。目前關于同種異體輸血導致的免疫抑制的機制仍不明確，已有報道顯示同種異體輸血能夠抑制自然殺傷（NK）細胞的功能[4-8]。本研究通過分析β重型地中海貧血兒童NK細胞的表達頻率及殺傷活性，旨在探討長期輸血對β重型地中海貧血兒童NK細胞細胞頻率及殺傷活性的影響，為重型β地中海貧血兒童臨床免疫監測和治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年1月～2013年12月在廣州市婦女兒童醫療中心及中山大學附屬第三醫院進行輸血治療長達3年的β重型地中海貧血兒童20例為β重型地中海貧血組，其中男13例，女7例，年齡（9.90±4.87）歲。排除貧血以外的其他疾病如細菌、病毒性感染、腫瘤等。選取同期同齡健康體檢兒童20例作為對照組，男 11例，女 9例，年齡（10.80±5.92）歲。 所有患者及患者家屬均知情同意。

1.2 儀器與試劑

BD LSRⅡ流式細胞儀 （美國BD公司），FITC標記的鼠抗人CD3、APC標記的鼠抗人CD56、PE標記的鼠抗人CD107a、鼠抗人lgG1同型對照抗體、紅細胞裂解液、阻斷劑GolgiStop均購自美國BD公司；刺激劑佛波酯（PMA）、鈣離子導入劑伊屋諾霉素（Ionomycin）購自美國Sigma公司，人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物。

1.3 研究方法

1.3.1 NK細胞比例分析 取100 μL無菌外周抗凝血，加入FITC標記的鼠抗人CD3、APC標記的鼠抗人CD56單克隆抗體各20 μL,室溫閉光孵育30 min，紅細胞裂解液室溫裂解15 min后用流式緩沖液離心洗滌兩次，500 μL流式緩沖液重懸，流式細胞儀檢測。

1.3.2 NK細胞CD107a表達分析 密度梯度離心無菌分離外周血單個核細胞 （PBMC）,將PBMC用完全1640培養基調整細胞濃度至1×106個/mL，置于24孔板，加入刺激劑 PMA（20 ng/mL），Ionomycin（1 μg/mL），PE標記的鼠抗人CD107a或同型對照抗體20 μL。1 h避光刺激后加入阻斷劑GolgiStop，繼續孵育5 h。加入FITC標記的鼠抗人CD3、APC標記的鼠抗人CD56單克隆抗體各20 μL,室溫閉光孵育30 min后用流式緩沖液離心洗滌2次，500 μL流式緩沖液重懸， 流式細胞儀檢測 NK細胞 （CD3－CD56+） 表面CD107a表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。非正態分布的計量資料用中位數（M）及四分位數（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK細胞細胞頻率

結果顯示：與對照組比較，β重型地中海貧血組外周血 NK 細胞頻率顯著減少[（4.5±2.8）%比（12.0±4.0）%]，差異有統高度計學意義（P=0.000）。 見圖 1。

2.2 NK細胞殺傷活性（CD107a）表達

圖1 NK細胞細胞頻率圖

結果顯示：β重型地中海貧血組外周血NK細胞表面 CD107a表達頻率為（23.9±7.4）%，對照組為（51.4±11.9）%，β重型地中海貧血組外周血NK細胞的殺傷活性顯著低于對照組，差異有統高度計學意義 （P=0.000）。 見圖 2。

3 討論

β地中海貧血是我國華南一帶尤其在廣西、廣東省發病率最高危害最大的遺傳病之一[9]。2007年的一項不完全統計顯示，廣州市β地中海貧血的發生率為11.26%，其中β地中海貧血（輕型，中間型）發生率為10.0%，β重型地中海貧血發生率為1.26%[10]。重型地中海貧血患兒的出生和地中海貧血基因的蔓延，已經嚴重影響了人口出生的質量，為社會和家庭帶來了沉重的經濟和心理負擔。

圖2 NK細胞殺傷活性（CD107a）表達分析圖

重型β地中海貧血的兒童需要以每3～4周1次的頻率接受長期的輸血治療才能維持生命，然而長期的貧血狀態以及大量輸血增加了機體鐵負荷，常導致患者自身免疫功能低下，易引起呼吸道感染等各種并發癥及臟器功能損害、壽命縮短等[11-12]。大量研究已經證實同種異體輸血可以導致免疫功能的抑制，而且許多學者認為，輸血誘導的免疫抑制是多種機制共同作用的結果。目前關于輸血導致的免疫抑制的機制仍不能確定，已經報道的有以下幾種：①同種異體輸血刺激了受血者的免疫系統，使Th1反應（細胞免疫）下調，Th2反應（體液免疫）上調[13]；②患者輸入的異體血中單核細胞分泌的前列腺素 E2（PGE2）增加[14]，PGE2有強烈的免疫抑制作用，減少了巨噬細胞HLA-Ⅱ類抗原的表達，抑制了白介素-2（IL-2）的產生，使得靶細胞對IL-2的反應性下降，Th1反應 （細胞免疫）下調，自然殺傷細胞（NK）活性下降，B細胞產生抗體的水平下調；③輸血能夠抑制NK細胞的功能。因此本研究組也推測長期輸血的β重型地中海貧血兒童的固有免疫系統特別是NK的功能可能受到了抑制。

本研究分析了β重型地中海貧血組NK細胞（CD3－CD56+） 的表達頻率及殺傷活性 （CD107a表達），發現其外周血NK細胞頻率及殺傷活性均顯著低于對照組，此可能與輸血誘導的NK細胞免疫抑制相關，其機制有待進一步深入研究。目前本研究組推測可能的NK細胞免疫抑制的分子機制有：①長期輸血導致調節性T細胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD8+Treg）的抑制功能增強，分泌的IL-10和TGF-β增加，NK細胞功能受到抑制；②懸浮紅細胞在保存過程中由于白細胞的崩解，產生的可溶性HLA-Ⅰ類抗原、FasL和TGF-β的產物增加，輸注后對NK細胞的功能起到一定的抑制作用；③異體血中的活性物質如PGE2、TGF-β、IL-10等或可溶性免疫介質HLA-Ⅰ類抗原、FasL等誘使受血者NK細胞表面NK細胞受體表達紊亂，活化型受體表達下調或抑制型受體上調，導致NK細胞傳導的抑制信號占優，NK細胞功能受到抑制。總之，進一步研究長期輸血β地中海貧血兒童輸血誘導的NK細胞免疫抑制的分子機制是下一步工作的重點，此將為β地中海貧血兒童臨床免疫監測和免疫干預治療提供重要的分子靶點和理論基礎。

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