黃瓜子不同炮制品中化學(xué)成分的對比

祝洪宇 隋 瑩 宋 寧 張洪長 紀(jì) 緒 陳 新

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117；2.長春市生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春 130000

黃瓜子，異名哈利蘇，為葫蘆科植物黃瓜Cucumis sativus L.的干燥成熟種子。黃瓜子具有潤腸清肺、接骨止痛和舒筋活絡(luò)的功效，臨床上常用于治療勞傷咳嗽、骨折和跌打損傷之證[1]。在民間早已有用黃瓜子治療骨科疾病的方法，且廣泛用于接骨壯骨及日常補(bǔ)鈣。黃瓜子中含有豐富的脂肪油，生食具有滑腸的作用。除特殊情況外，臨床應(yīng)用黃瓜子大多為黃瓜子的炮制品。目前對黃瓜子炮制方法的研究報(bào)道較少，根據(jù)傳統(tǒng)中藥炮制理論“逢子必炒”的原則，現(xiàn)在仍采用傳統(tǒng)的清炒法炮制黃瓜子。本次試驗(yàn)運(yùn)用微波炮制法對黃瓜子進(jìn)行炮制，通過對比生品及兩種炮制品中鈣磷比、氨基酸及脂肪油的含量，比較炮制方法對黃瓜子中化學(xué)成分的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FAD04B 型電子分析天平（1/10000），LXJ-IB 型低速大容量多管離心機(jī)，Spectrumlab752S型紫外-可見分光光度計(jì)，電阻爐，GZX-9240型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，AS20500A型超聲波清洗儀，HH-S型恒溫水浴鍋；精氨酸對照品、亮氨酸對照品、谷氨酸對照品及亞油酸對照品均購自中國生物制品研究所，蒸餾水、去離子水、其他試劑均為化學(xué)基準(zhǔn)試劑或分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜子樣品的炮制

黃瓜子購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種子公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為葫蘆科黃瓜屬黃瓜Cucumis sativus L.的干燥成熟種子。黃瓜子的不同炮制品均為自制。

1.2.1.1 黃瓜子生品 夏、秋季采收成熟的果實(shí)，剖開，取出種子，洗凈，曬干。

1.2.1.2 黃瓜子清炒品 取黃瓜子生品500 g，置炒鍋內(nèi)，用文火炒至黃瓜子種皮鼓起且顏色加深，有噼啪聲且伴有香氣溢出時(shí)，取出，放涼。計(jì)算得率。

1.2.1.3 黃瓜子微波炮制品 取黃瓜子生品500 g，分次置于微波爐內(nèi)，中等火力加熱4 min，取出，放涼。計(jì)算得率。

1.2.2 黃瓜子樣品鈣和磷的測定

1.2.2.1 供試試劑的制備 ①混合酸消化液：分別取硝酸和高氯酸，按體積比4∶1的比例混合均勻，即得。②甲基橙指示劑：取甲基橙0.1 g，加水100 mL使溶解，即得。變色范圍：pH 3.2～4.4（紅→黃）。③乙酸溶液：取乙酸2 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，即得。④氨水溶液：取氨水2 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，即得。⑤4%草酸銨水溶液：取草酸銨4 g，加水溶解并稀釋至100 mL，即得。⑥1 mol/L硫酸溶液：取濃硫酸60 mL緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀釋至1000 mL，搖勻，即得。⑦0.02 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液[3]：A.高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取高錳酸鉀3.2 g，精密稱定，溶于1000 mL水中，蓋上表面皿，煮沸15 min，密塞，靜置1周后，用垂熔玻璃濾器濾過，即得。B.高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：取在105℃干燥至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉0.2 g，精密稱定，加水250 mL與濃硫酸10 mL，攪拌使溶解，自滴定管中迅速加入高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液25 mL（邊加邊振搖，以避免產(chǎn)生沉淀），待褪色后，加熱至65℃，繼續(xù)滴定至溶液顯微紅色并保持30 s不褪色；當(dāng)?shù)味ńY(jié)束時(shí)，溶液溫度應(yīng)不低于55℃，每1毫升高錳酸鉀滴定液（0.02 mol/L）相當(dāng)于6.70 mg的草酸鈉。根據(jù)本液的消耗量與草酸鈉的用量，算出高錳酸鉀滴定液的濃度。⑧15%硫酸溶液：取15 mL濃硫酸緩慢加入到80 mL水中混勻，冷卻后用水稀釋至100 mL。⑨鉬酸銨溶液：取鉬酸銨5 g，精密稱定，用15%硫酸溶液溶解并稀釋至100 mL，搖勻，即得。⑩亞硫酸鈉溶液：取亞硫酸鈉10 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。11對二苯酚溶液：取對二苯酚0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水50 mL使溶解，并加入1滴濃硫酸，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。12磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：取在105℃干燥至恒重的磷酸二氫鉀0.43 g，精密稱定，置1000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。13磷標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 μg/mL）：精密量取磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.2 消化液的制備 分別取上述3種黃瓜子樣品，粉碎，過60目篩。各取樣品粉末1 g，精密稱定，分別置250 mL燒杯中，加少量去離子水濕潤后，加入25 mL混合酸消化液，置電爐上加熱消化至無色透明，加25 mL去離子水，加熱除去多余的硝酸。待燒杯中的液體接近5～6 mL時(shí)，取下，放至室溫，加20 mL去離子水，并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 黃瓜子樣品中鈣含量的測定[2-10]精密移取上述3種樣品的消化液各5 mL，分別置15 mL離心管中，依次加入1滴甲基橙指示劑、1 mL 4%的草酸銨水溶液及0.5 mL乙酸溶液，加氨水溶液調(diào)至微黃色，再用乙酸溶液調(diào)節(jié)溶液至紅色，靜置1 h，使沉淀全部析出，離心 20min（轉(zhuǎn)速為 3500 r/min），傾去上清液，用濾紙吸干殘余溶液，加4 mL 15%硫酸溶液溶解沉淀，并用50 mL去離子水清洗并轉(zhuǎn)移至250 mL三角燒瓶中，搖勻，置電磁攪拌器上加熱至75～85℃，使沉淀溶解，用標(biāo)定過的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色，溶液30 s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，記錄高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量，具體公式為其中W：樣品中的鈣含量，mg/g；C：高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V：高錳酸鉀滴定液消耗體積，mL；M：為Ca的相對原子質(zhì)量，g/mol；V1：用于測定樣品溶液體積，mL；V2：樣品溶液定容總體積，mL；ms：樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2.4 黃瓜子樣品中磷含量的測定[11-12]①磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于20 mL具塞試管中，加入2 mL鉬酸銨溶液，搖勻并靜置10 s，再依次加入1 mL亞硫酸鈉溶液和1 mL對二苯酚溶液，搖勻，加水稀釋至刻度，混勻后靜置0.5 h，在660 nm波長下測定吸光度，以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。②樣品溶液中磷含量的測定：精密量取上述3種樣品消化液各10 mL，分別置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液2 mL，置20 mL具塞試管中，其余操作步驟同“磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下的制備方法。根據(jù)測出的吸光度計(jì)算磷含量，具體公式為 X=CV1/mV2，其中 X：樣品中磷含量，mg/g；C：由回歸方程計(jì)算得的樣品測定液中磷的含量，mg；V1：樣品消化液定容體積，mL；V2：測定用樣品消化液的體積，mL；m：樣品質(zhì)量，g。 經(jīng)測定，磷元素在磷含量 5～50 μg范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性關(guān)系良好，回歸方程：y=0.0114x-0.0108，r=0.9998，其中 y 為吸光度，x 為磷含量（μg），結(jié)果見圖 1。

1.2.3 黃瓜子樣品中氨基酸的薄層層析研究

取上述3種黃瓜子樣品粉末各2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加8倍量的蒸餾水浸泡30 min，超聲提取20 min。過濾，濾液置恒溫水浴鍋上水浴蒸干，加80%乙醇溶解，過濾，制成5 mL的供試品溶液。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.2 黃瓜子樣品中脂肪類成分的薄層層析研究取上述3種黃瓜子樣品的脂肪油各0.5 g，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取亞油酸對照品，加石油醚溶解制成每1毫升含有亞油酸1 mg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取3種供試品溶液與對照品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（8.5∶1.5∶0.03）為展開劑，展距為 15 cm，以 5%的磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑，于100℃下加熱5 min。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜子炮制品得率

取精氨酸對照品、亮氨酸對照品、谷氨酸對照品精密稱定，分別加80%乙醇制成每1毫升含精氨酸10 μg，每1毫升含亮氨酸20 μg和每1毫升含谷氨酸20 μg的對照品溶液。精密吸取3種供試品溶液及3種對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3.5∶1∶1）為展開劑，展開；以 0.2%的茚三酮乙醇溶液為顯色劑，在110℃下加熱10 min。

1.2.4 黃瓜子樣品中脂肪油的研究

1.2.4.1 脂肪油的含量測定 取上述3種黃瓜子樣品粉末各5 g，精密稱定，分別置于索氏提取器中，以乙醚為提取溶劑，加熱回流提取8 h，至脂肪油提盡，收集提取液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上低溫蒸干，蒸干后，將蒸發(fā)皿置烘箱中100℃干燥1 h，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，計(jì)算，即得。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 黃瓜子炮制品情況統(tǒng)計(jì)

2.2 黃瓜子樣品中鈣和磷的含量

按照上述測定鈣和磷的方法，分別測定3種黃瓜子樣品中的鈣和磷，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，并計(jì)算鈣磷比，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炮制后，黃瓜子中鈣含量較生品略微降低，磷含量有所提高。

表2 黃瓜子樣品中鈣和磷的含量（n=5）

2.3 黃瓜子樣品中氨基酸薄層層半定量研究

按照上述氨基酸的測定方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，微波制品斑點(diǎn)面積最大，顏色最深，清炒品次之，生品斑點(diǎn)最小，顏色最淺，表明氨基酸的含量黃瓜子微波制品和清炒品均高于生品。

2.4 黃瓜子樣品中脂肪油的研究

2.4.1 黃瓜子樣品中脂肪油的含量測定

按照上述脂肪油方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜子微波制品的脂肪油含量最高，清炒品次之，生品含量最低。

2.4.2 黃瓜子樣品中脂肪類成分薄層層析定量研究

按照上述的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，黃瓜子炮制品與生品的色譜行為基本一致，黃瓜子微波炮制品的亞油酸斑點(diǎn)顏色最深，面積最大，斑點(diǎn)最清晰。

3 討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的炮制方法對黃瓜子中的化學(xué)成分有不同程度的影響。人體中的牙齒和骨骼主要是由鈣和磷以鹽的形式構(gòu)成，鈣和磷是一對具有協(xié)同作用的礦物元素，磷能有效促進(jìn)人體對鈣的吸收，但是過量的磷則會干擾鈣的吸收，使鈣大量流失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和蛀牙。經(jīng)過炮制，黃瓜子中的鈣元素含量升高，磷含量降低。黃瓜子生品的鈣磷比為2.79∶1，黃瓜子清炒品的鈣磷比為2.45∶1，而黃瓜子微波制品的鈣磷比為2.26∶1，最接近人體骨骼鈣磷比，為臨床應(yīng)用黃瓜子治療骨質(zhì)疏松提供了理論依據(jù)。與生品相比較，兩種炮制品的氨基酸、脂肪油含量均有提高。微波炮制的黃瓜子與炒品相比，藥材的炮制得率高，損失小，且氨基酸含量及脂肪油含量均高于清炒品。微波炮制法是利用微波能量集中，選擇性高，穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，使藥材本身的水分子的發(fā)生震動，產(chǎn)生熱能進(jìn)而達(dá)到炮制的目的。

圖2 黃瓜子樣品中氨基酸的薄層色譜圖

表3 黃瓜子樣品中脂肪油的含量（n=3）

圖3 黃瓜子不同炮制品脂肪類成分薄層色譜圖

本次實(shí)驗(yàn)針對黃瓜子不同炮制品的化學(xué)成分進(jìn)行了簡單的對比分析，通過實(shí)驗(yàn)可知，用微波炮制法炮制的黃瓜子，各項(xiàng)指標(biāo)均高于傳統(tǒng)的清炒法，其原因可能是微波炮制法炮制的黃瓜子，受熱均勻，溫度穩(wěn)定，使有效成分含量提高，且利用微波穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，提高破壁率，有利于有效成分的溶出[13-14]。微波炮制法作為一種新興的炮制方法，在近年來的各項(xiàng)研究中被廣泛應(yīng)用。許多研究已證實(shí)，合理的炮制方法可以提高藥物療效，降低藥物毒性，與傳統(tǒng)炮制方法相比較，用微波法炮制藥材，可以提高藥材利用率，節(jié)省能源，簡單快捷無污染，但是作為新的炮制方法，在安全性方面還需要進(jìn)一步的長期研究，以確保對人體無害。

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