一株拮抗腐霉病菌的枯草芽孢桿菌的分離鑒定及誘變選育

司賀龍等

摘要：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可產生多種抗菌蛋白、抗生素及酶類抗菌物質，對多種植物病原真菌有良好的防治效果。通過從土壤中分離抑真菌活性的枯草芽孢桿菌，并進行UV-NaNO2物理化學聯合誘變，獲得一株對腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）具有較強拮抗作用的菌株。突變菌株的生長速率、耐高溫性均較出發菌株有較大提高，盆栽試驗表明誘變菌株較出發菌株對腐霉病菌引發的黃瓜腐霉病具有更好的防治作用。

關鍵詞：拮抗細菌；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；UV-NaNO2復合誘變；腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）

中圖分類號：S476.1；Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3805-04

Abstract： Bacillus subtilis can produce a variety of antibacterial protein， antibiotics and antibacterial substances，which have fine control efficiency for plant pathogenic fungi. An antagonistic bacterium strain was obtained by isolating the antifungal activity from the soil and UV-NaNO2 combination mutagenesis. A strain with strong antagonism to Pythium aphanidermatum was obtained. The growth rate and heat resistance was highly improved than those of the original strain. The result showed that the strain had better controling effect against Pythium aphanidermatum.

Key words： plant pathogenic fungi； Bacillus subtilis；UV- NaNO2 mutagenesis； Pythium aphanidermatum

隨著化學農藥的長期使用，環境污染和農藥殘留的弊端日益凸顯，生物防治植物病害成為目前農業生產和科研中的重要內容之一。植物病原微生物和環境微生物之間的相互作用研究發現，利用有益微生物及其產生的代謝產物可以有效地防治或減輕植物病害對農作物的危害，具有保護生態環境和產品無農藥殘留等優點，為農作物病害的生物防治實踐提供了有力支撐。

可用于植物病害防治的微生物種類較多，包括真菌（如木霉菌）、放線菌、細菌以及病毒等。目前使用較成功的生防細菌主要為芽孢桿菌（Bacillus sp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas sp.）、歐文菌（Erwinia sp.）。芽孢桿菌作為一類大量存在于自然界的腐生細菌，具有生長快、營養簡單、可以形成抗逆能力較強的芽孢等特點，已被廣泛應用到農業、畜牧業、環保等領域[1]。利用具有拮抗作用的芽孢桿菌防治病原菌是當前生物防治植物病害的主要手段之一[2]。如從Solerotium rolfsti的溶裂菌絲中分離獲得的Bacillus subtilis A13菌株可以有效地在植物根部定殖，通過自身產生抗生素等功能抑制病原菌，同時該菌株能夠刺激植物生長，比如可促進胡蘿卜、燕麥和花生不同程度的增產，該菌株產品以商品QUANTUM-400作為花生處理劑銷售推廣[3]。在美國，GB03菌株用于防治由Rhizoctonia spp.和Fusarium spp.引起的病害，能促進植物生長，產品以商品Kodiak在美國和歐洲等地廣泛應用[4]。中國農業大學研制的增產菌也主要由Bacillus spp.組成，具有防病和促進植物生長的作用[5]。王金生等[6]分離得到的生防菌株Bacillus subtilis B1對于防治大白菜軟腐病和促進增產有明顯的效果。

物理或化學誘變在提高生防菌抑菌活性及抗性方面得到了廣泛的應用。高菲等[7]采用紫外線和微波照射方法對出發菌株熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）GF-312進行復合誘變，獲得一株拮抗草莓腐霉病菌效果明顯優于出發菌株的誘變菌株GF-16。向家云等[8]采用微波輻照，對檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）進行誘變，選育到一株對柑橘青霉病抑菌活性較出發菌株提高了16.90%的突變株W50256。任濤濤等[9]利用He-Ne激光與氯化鋰復合誘變枯草芽孢桿菌WB3，篩選到對番茄灰霉病菌拮抗能力有顯著提高且穩定性強的突變菌株L8。陳瑞勤[10]通過紫外線-亞硝酸復合誘變綠僵菌（Metarhizium anisopliae）M105-3，選育出孢子海藻糖含量顯著提高的誘變株，該誘變菌株的耐熱性、耐儲藏性及紫外線抗性有顯著提高，且遺傳性狀相對穩定。

本研究對從土壤分離的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株經UV-NaNO2復合誘變后獲得的突變菌株進行了特征特性鑒定，并對其防治腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）的離體拮抗和盆栽效果進行了測定，為開發防治植物病害的生物制劑提供資源。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌從河北衡水溫室土壤中分離獲得。腐霉病菌由河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存。

1.2 菌株的分離

稱取10 g從河北衡水市溫室內采回的健康黃瓜植株根際土壤，用90 mL無菌水混勻，然后從中取1 mL用9 mL無菌水進行稀釋，重復進行，最終成10-6、10-7、10-8 3個梯度菌懸液。移取3個梯度的菌懸液100 μL，涂布于LB固體培養基平板上，根據菌落形態，挑取單菌落，劃線純化后4 ℃保藏，備用。

1.3 拮抗活性菌株的形態、生理生化特征測定及16S rDNA序列分析

形態及生理生化特征檢測參照參考文獻[11]。16S rDNA PCR擴增參考成麗霞等[12]的方法，進行擴增產物克隆測序，并利用DNAman軟件進行系統發育分析。

1.4 菌株誘變及篩選

采用UV-NaNO2復合誘變[13]。

吸取已制備的菌懸液10 mL（107 CFU/mL）于培養皿中，暗室30 W紫外線（UV）燈下30 cm處分別照射0、30、60、90、120、150、180 s；將1 mL 0.1 mol/L的NaNO2和1 mL分別經不同時間UV照射的菌懸液與1 mL醋酸緩沖液在30 ℃水浴1、3、5、7、9 min，處理后加7 mL pH為8.6的Na2HPO4溶液終止反應。取樣0.1 mL涂布LB平板，與未經處理的菌懸液所涂平板對照進行比較，計算致死率，選擇致死率為80%以下生長出的單菌落進行拮抗試驗。

致死率=（對照菌落數-處理菌落數）/對照菌落數×100%。

1.5 拮抗活性菌株的篩選

采用平板對峙法篩選拮抗活性菌株，并測定菌株的抑菌率，選擇抑菌率值大的菌株進行傳代，從中挑選遺傳性狀穩定的菌株進入下一步試驗。

抑菌率=（對照組病原菌的菌落直徑-試驗組病原菌的菌落直徑）/對照組病原菌的菌落直徑×100%。

1.6 菌株對盆栽黃瓜腐霉病菌的防治效果測定

黃瓜種子經雙氧水表面消毒，無菌水浸泡2 d，種植于滅菌的土壤中，待幼苗長至4～5葉期時進行防效試驗。試驗組每株黃瓜幼苗接種15 mL枯草芽孢桿菌菌懸液（孢子1×106個/mL）和15 mL黃瓜腐霉病菌孢子懸浮液（孢子1×106個/mL）；接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤。對照組（CK）每株黃瓜幼苗接種15 mL超純水和15 mL黃瓜腐霉病菌孢子懸浮液（孢子1×106個/mL）；接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤。接種孢子懸浮液20 d后調查發病率，對照CK計算病情指數。黃瓜腐霉病分級調查標準見表1，試驗重復3次，并采用DPS軟件進行數據統計。

發病率=發病苗數/調查苗數×100%。

病情指數=100×∑（各級病葉數×各級病級值）/（調查總葉數×最高病級值）。

防效=（對照組病情指數-處理組病情指數）/對照組病情指數×100%。

1.7 菌株耐高溫測試

液體培養基培養各菌株，將進入對數生長期的培養液分別置于37、42、47 ℃的搖床中，220 r/min培養5 h，測定OD600 nm， 進行分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

通過對根際土壤微生物的篩選，共獲得36株細菌菌株，其中8株為枯草芽孢桿菌菌株，經平板對峙法篩選最終分離純化得到一株具拮抗作用的菌株D2。

2.2 D2菌株鑒定

菌株D2在LB培養基上培養，菌落呈不規則的不透明突起狀，粗糙有褶皺，褶皺有完整的膜，淡黃色，黏稠，圓形。革蘭氏染色為陽性菌，生理生化特性見表2，該菌株能利用淀粉，接觸酶試驗、明膠水解和卵磷脂水解為陽性，能夠在6.5%NaCl溶液中生長。以D2的基因組DNA為模板，用通用引物進行PCR擴增，得到約1.5 kb的16S rDNA片段，經測序比對分析顯示，該菌株與Bacillus subtilis同源性最高，利用DNAman構建的系統發育樹見圖1，該菌株與枯草芽孢桿菌親緣關系最近， 位于同一分支。結合形態學、生理生化特征及16S rDNA序列比對結果，確定D2菌株為枯草芽孢桿菌。

2.3 D2菌株誘變

分別對紫外線照射及NaNO2處理D2菌株不同時間后的致死率進行統計分析，圖2為菌株D2菌懸液受紫外線不同照射時間后的致死率變化情況。由圖2可知，隨著紫外線照射時間的延長，致死率上升，當照射時間為60 s時，菌株的致死率超過60%，當照射時間為140 s時其致死率接近100%。圖3為菌株D2菌懸液在NaNO2處理不同時間后的致死率。由圖3可知，當處理時間300 s時，菌株的致死率超過80%，當處理時間為360 s時其致死率接近100%。結合上述致死率變化情況，選取復合誘變時間為紫外線照射80 s，NaNO2處理300 s。

2.4 誘變菌株的篩選

對D2菌株進行復合誘變之后共獲得了150多株單菌落菌株，對其進行對峙培養，比較抑菌率值之后獲得4株相對D2原始菌株有較強抑菌能力的突變株，分別編號為D2-1、D2-2、D2-3、D2-4，其抑菌圈情況見表3。但是經過10次傳代后，D2-3、D2-4均有不同程度的恢復，所以對D2-1和D2-2菌株進行保存，并以D2-1進行后續試驗。

2.5 突變菌株的耐高溫性

通過對野生型和突變菌株進行不同溫度下的生長速率的測定（表4），發現野生型和突變菌株雖然都能在42 ℃下生長；但在溫度高達47 ℃時，野生型幾乎不能生長，而突變菌株的生長速度明顯快于野生型。從而明確突變菌株的耐高溫性明顯強于野生型。

2.6 盆栽試驗效果

溫室盆栽試驗結果（表5）表明，所有供試的枯草芽孢桿菌菌株均對腐霉病菌表現出良好的抑制作用，該菌對處理后的黃瓜幼苗生長有明顯的促進作用，且能增加開花數量，減輕發病率，降低病情指數。經誘變篩選獲得的突變菌株D2-1較出發菌株D2對病原真菌具有更好的防治作用。

3 小結與討論

植物真菌病害是降低農作物產量和品質的重要因素，長期以來使用化學農藥防治病害對農業生產起到了十分重要的促進作用，但是由于化學農藥的大量使用，已經對農業生產和人類健康帶來較多負面作用，造成了人類健康及生態平衡等一系列問題，促使人們探尋一種更好的防治途徑，實施對人類和環境無害并具良好防治效果的防治策略。隨著生物農藥制劑的快速發展，微生物制劑已經成為替代或減少化學農藥使用的新型防治措施之一，受到學者、企業和消費者的青睞。

目前，應用較多的生防細菌是促進植物生長的根際細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對植物的有益作用主要表現在防病和刺激生長兩個方面。對病害的防治機制包括拮抗、寄生、競爭等多種方式，產生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細菌通過定殖于根系和優先占領根系或抑制根上有害細菌或真菌的生長從而達到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產芽孢革蘭氏陽性桿狀細菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對人畜無毒無害且不污染環境。由于它生長速度快、養分需求簡單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產工藝簡單，使用方便，儲存期長，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發達國家的無公害農業種植中得以廣泛的應用。已研究表明，Bacillus subtilis所產抗菌物質大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性細菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農作物腐爛、猝倒、生長緩慢等癥狀，并且在苗期發病較為嚴重，造成大量死苗，從而影響農作物產量和質量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對其中1株突變菌株進一步研究發現，突變菌株的生長速率較快，較短的培養時間就能積累較高產量的菌體，說明其能較快定殖于根際，達到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產和應用中具有極為重要的價值，可以使微生物制劑對外界環境有更廣的適應性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗證了用UV-NaNO2復合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

參考文獻：

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（責任編輯 陳 焰）

目前，應用較多的生防細菌是促進植物生長的根際細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對植物的有益作用主要表現在防病和刺激生長兩個方面。對病害的防治機制包括拮抗、寄生、競爭等多種方式，產生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細菌通過定殖于根系和優先占領根系或抑制根上有害細菌或真菌的生長從而達到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產芽孢革蘭氏陽性桿狀細菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對人畜無毒無害且不污染環境。由于它生長速度快、養分需求簡單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產工藝簡單，使用方便，儲存期長，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發達國家的無公害農業種植中得以廣泛的應用。已研究表明，Bacillus subtilis所產抗菌物質大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性細菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農作物腐爛、猝倒、生長緩慢等癥狀，并且在苗期發病較為嚴重，造成大量死苗，從而影響農作物產量和質量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對其中1株突變菌株進一步研究發現，突變菌株的生長速率較快，較短的培養時間就能積累較高產量的菌體，說明其能較快定殖于根際，達到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產和應用中具有極為重要的價值，可以使微生物制劑對外界環境有更廣的適應性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗證了用UV-NaNO2復合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

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（責任編輯 陳 焰）

目前，應用較多的生防細菌是促進植物生長的根際細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對植物的有益作用主要表現在防病和刺激生長兩個方面。對病害的防治機制包括拮抗、寄生、競爭等多種方式，產生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細菌通過定殖于根系和優先占領根系或抑制根上有害細菌或真菌的生長從而達到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產芽孢革蘭氏陽性桿狀細菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對人畜無毒無害且不污染環境。由于它生長速度快、養分需求簡單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產工藝簡單，使用方便，儲存期長，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發達國家的無公害農業種植中得以廣泛的應用。已研究表明，Bacillus subtilis所產抗菌物質大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性細菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農作物腐爛、猝倒、生長緩慢等癥狀，并且在苗期發病較為嚴重，造成大量死苗，從而影響農作物產量和質量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對其中1株突變菌株進一步研究發現，突變菌株的生長速率較快，較短的培養時間就能積累較高產量的菌體，說明其能較快定殖于根際，達到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產和應用中具有極為重要的價值，可以使微生物制劑對外界環境有更廣的適應性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗證了用UV-NaNO2復合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

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（責任編輯 陳 焰）