四種抗生素與牛血清蛋白相互作用的紫外吸收光譜研究

薛春霞　董社英

摘要：利用紫外吸收光譜法研究了頭孢地尼（CDR）、克林霉素（CLMC）、羅紅霉素（RM）和卡那霉素（KLMC）4種抗生素類藥物與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，并對其結合反應機理進行初步探討，同時以CDR分子為基體研究了BSA對藥物分子的影響。結果表明，在人體生理pH值試驗條件下CDR、CLMC、RM及KLMC與BSA的結合常數分別為1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol，用Scatchard擬合法求得CDR與BSA的結合常數為0.88×105 L/mol，兩種方法結果基本一致。

關鍵詞：牛血清白蛋白；克林霉素；羅紅霉素；卡那霉素；頭孢地尼；紫外吸收光譜法

中圖分類號：O657.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3855-04

Abstract： The interactions between bovine serum albumin（BSA） and four antibiotics including Cefdinir（CDR）， clindamycin（CLMC）， roxithromycin（RM）， Kalamycin（KLMC）were analyzed with UV absorption spectrometry. The binding mechanism was discussed. The effect of BSA on CDR molecule was studied. The results showed that the binding constants of CDR–BSA， CLMC-BSA， RM-BSA and KLMC-BSA under physical pH were 1.02×105， 1.24×104， 1.38×103 and 1.04×103 L/mol， respectively. The result of CDR-BSA obtained from Scatchard fitting method was 0.88×105 L/mol， similar to that from the Lineweaver-Burk method.

Key words： bovine serum albumin（BSA）； clindamycin；roxithormycin； kalamycin； cefdinir； UV absorption spectroscopy

血清白蛋白是血漿中一種重要的運輸蛋白，當藥物分子進入人體后，通過血漿的貯存和運輸，達到受體部位發生藥理作用。藥物與血清白蛋白在體內可產生不同程度的結合，這種結合將影響藥物的配置及藥理作用，對藥效學和藥動力學起著重要的作用[1]。因此，血清白蛋白與許多藥物的相互作用研究已逐漸成為化學、生命科學和醫藥學等學科研究領域中活躍的熱點之一[2-4]。

所研究的4種抗生素頭孢地尼（Cefdinir，CDR）、克林霉素（clindamycin，CLMC）、羅紅霉素（roxithromycin，RM）及卡那霉素（Kalamycin， KLMC）均具有廣譜抗菌性，其結構如圖1所示。本試驗首先以BSA為基體，在人體生理pH值條件下研究CDR對BSA紫外光譜的影響，利用Lineweaver-Burk雙倒數法測定了各抗生素藥物分子與BSA間的結合常數等重要相互作用信息。在此基礎上，又以CDR分子為基體，研究BSA對CDR紫外光譜的影響，用Scatchard擬合法求得兩者之間的結合常數并與Lineweaver-Burk雙倒數法的結果進行比較，從不同角度為生命科學研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Nicolet Evolution 300型紫外-可見分光光度計（英國）；IX–501A型pH計（北京大學化學系）；Z-SJ60-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子秤量儀器有限公司）。

BSA（上海國藥集團化學試劑有限公司）：分子質量以67 000 Da計，1.0×10-4 mol/L 標準儲備溶液，4 ℃冰箱保存，用時適當稀釋；2.0×10-3 mol/L的CDR、CLMC、RM及KLMC（中國藥品生物制品檢定所）標準儲備溶液，用時適當稀釋；pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

將一定量的BSA與各抗生素溶液依次加入到10 mL比色管中，用pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液稀釋至刻度，振蕩均勻，靜置15 min，用相應的緩沖溶液作參比，在190～320 nm波長范圍內分別測定蛋白質及其與各抗生素混合溶液的紫外吸收光譜。

將一定量的CDR及其與BSA混合溶液依次加入到10 mL比色管中，用pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液稀釋至刻度，振蕩均勻，靜置15 min，用相應的緩沖溶液作參比，在190～320 nm波長范圍內分別測定CDR及其與BSA混合溶液的紫外吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 CDR、RM、CLMC、KLMC對 BSA的紫外吸收光譜影響

在所選擇的試驗條件下BSA在紫外光譜區顯示兩個特征吸收帶。其中206.0 nm處的特征吸收峰主要由肽鍵上C=O基的π-π*躍遷引起，與BSA分子的α-螺旋含量有關[5]；而278.0 nm處的特征吸收峰主要由BSA分子中肽鏈上的2個色氨酸殘基的吲哚環和19個酪氨酸殘基的芳雜環的π-π*躍遷所引起[6]。CDR、RM對BSA紫外吸收光譜的影響如圖2所示，當固定cBSA 為4.0×10-6 mol/L時，隨著加入CDR濃度的增加，BSA在278.0 nm處的吸收呈現明顯的增色效應，最大吸收峰位發生紅移；而加入一系列不同濃度的RM溶液時，隨著RM濃度的增加，BSA在278.0 nm處的吸收呈現明顯的減色效應，最大吸收峰位幾乎不發生移動，CLMC、KLMC對BSA 278.0 nm處吸收的影響與RM相似。endprint

比較4種抗生素的結構（圖1）可知，CDR結構中含有羧基，容易解離，當CDR的濃度逐漸升高時，離子誘導BSA分子發生類似于降低pH所出現的蛋白質肽鏈伸展現象[5]，使包圍在BSA分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來，從而使278.0 nm吸收峰的吸收增強，同時使疏水基團之間的疏水作用增強、吸收峰紅移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多個羥基與BSA肽鏈中的氨基酸殘基中的含氧或含氮基團之間可形成氫鍵，從而使氨基酸殘基中含氧或含氮基團原有的鍵強減弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC與BSA的結合反應

紫外吸收光譜可以用來測定藥物分子與蛋白質的結合常數，藥物分子與蛋白質的結合可以表示為[8]：

2.3 BSA對CDR紫外吸收光譜的影響

為了進一步了解4種抗生素與BSA的相互作用信息，現以各抗生素為基體，研究BSA對其紫外光譜的影響。由于RM、CLMC與BSA本身的吸收峰有部分重疊，其相互作用的研究受到干擾；而KLMC在紫外吸收區沒有吸收峰；故本研究僅考察BSA對CDR藥物分子紫外吸收光譜的影響。

在所選擇的試驗研究條件下，CDR在紫外區的3個吸收峰分別為203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。試驗研究表明，BSA與CDR發生相互作用在286.0 nm表現最為明顯，所以選擇286.0 nm處的吸收峰為主要研究對象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，隨著加入BSA濃度的增加，CDR的吸收呈現明顯的增色效應，最大吸收峰位藍移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*躍遷引起，因此表明BSA與CDR的C=O有明顯的相互作用，但更具體的位置有待進一步研究。

根據Scatchard模型方程[9]，以ΔA對ΔA/CBSA作圖，由擬合直線的斜率可以求得結合常數KA。CDR能滿足Scatchard擬合，其擬合的線性程度較好（圖5）。線性回歸方程為y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用結合常數為0.88×105 （mol/L）-1。與用Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得BSA與CDR的結合常數相符。

3 小結

本研究利用紫外吸收光譜詳細研究了BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。結果表明，BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC均發生了結合作用；CDR與BSA之間存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC與BSA之間主要通過氫鍵作用結合，并由Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得CDR、CLMC、RM和KLMC與BSA的結合常數分別為：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同時以CDR為基體，研究BSA對CDR紫外光譜的影響，用Scatchard 擬合法求得結合常數為0.88×105 L/mol，兩種方法結果接近。

參考文獻：

[1] 田 媛，陳艷華，畢淑云，等.表面等離子體子共振傳感器研究頭孢菌素類藥物與白蛋白的相互作用[J].分析化學，2006，34（7）：967-970.

[2] 劉家琴，田建裊，謝建平，等.厚樸酚與人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化學，2006，34（3）：557-560.

[3] 陳曉波，康棟國，李 崧，等.利福平與人血清白蛋白作用的熒光光譜[J].光譜學與光譜分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，劉永明，虢新運，等.熒光法研究鹽酸拓撲替康、鹽酸依利替康喜樹堿類藥物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化學學報， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黃 艷，賀 群.銥（Ⅳ）離子與人血丙種球蛋白的作用研究[J].化學學報，2005，63（3）：223-228.

[6] 張朝紅，臧樹良，耿 兵.三苯基錫化合物與牛血清白蛋白作用光譜[J].應用化學，2005，22（5）：489-493.

[7] 馮玉英，吳曉紅，周家宏.竹紅菌甲素與血紅蛋白相互作用光譜[J].應用化學，2005，22（8）：895-898.

[8] 劉 媛，謝孟峽，康 娟.三七總皂甙對牛血清白蛋白溶液構象的影響[J].化學學報，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之寧，陰永光，等.紫外光譜研究中藥大黃有效成分與牛血清白蛋白的相互作用[J].中國現代應用藥學雜志，2004，21（6）： 429-432.

（責任編輯 程碧軍）endprint

比較4種抗生素的結構（圖1）可知，CDR結構中含有羧基，容易解離，當CDR的濃度逐漸升高時，離子誘導BSA分子發生類似于降低pH所出現的蛋白質肽鏈伸展現象[5]，使包圍在BSA分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來，從而使278.0 nm吸收峰的吸收增強，同時使疏水基團之間的疏水作用增強、吸收峰紅移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多個羥基與BSA肽鏈中的氨基酸殘基中的含氧或含氮基團之間可形成氫鍵，從而使氨基酸殘基中含氧或含氮基團原有的鍵強減弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC與BSA的結合反應

紫外吸收光譜可以用來測定藥物分子與蛋白質的結合常數，藥物分子與蛋白質的結合可以表示為[8]：

2.3 BSA對CDR紫外吸收光譜的影響

為了進一步了解4種抗生素與BSA的相互作用信息，現以各抗生素為基體，研究BSA對其紫外光譜的影響。由于RM、CLMC與BSA本身的吸收峰有部分重疊，其相互作用的研究受到干擾；而KLMC在紫外吸收區沒有吸收峰；故本研究僅考察BSA對CDR藥物分子紫外吸收光譜的影響。

在所選擇的試驗研究條件下，CDR在紫外區的3個吸收峰分別為203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。試驗研究表明，BSA與CDR發生相互作用在286.0 nm表現最為明顯，所以選擇286.0 nm處的吸收峰為主要研究對象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，隨著加入BSA濃度的增加，CDR的吸收呈現明顯的增色效應，最大吸收峰位藍移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*躍遷引起，因此表明BSA與CDR的C=O有明顯的相互作用，但更具體的位置有待進一步研究。

根據Scatchard模型方程[9]，以ΔA對ΔA/CBSA作圖，由擬合直線的斜率可以求得結合常數KA。CDR能滿足Scatchard擬合，其擬合的線性程度較好（圖5）。線性回歸方程為y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用結合常數為0.88×105 （mol/L）-1。與用Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得BSA與CDR的結合常數相符。

3 小結

本研究利用紫外吸收光譜詳細研究了BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。結果表明，BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC均發生了結合作用；CDR與BSA之間存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC與BSA之間主要通過氫鍵作用結合，并由Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得CDR、CLMC、RM和KLMC與BSA的結合常數分別為：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同時以CDR為基體，研究BSA對CDR紫外光譜的影響，用Scatchard 擬合法求得結合常數為0.88×105 L/mol，兩種方法結果接近。

參考文獻：

[1] 田 媛，陳艷華，畢淑云，等.表面等離子體子共振傳感器研究頭孢菌素類藥物與白蛋白的相互作用[J].分析化學，2006，34（7）：967-970.

[2] 劉家琴，田建裊，謝建平，等.厚樸酚與人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化學，2006，34（3）：557-560.

[3] 陳曉波，康棟國，李 崧，等.利福平與人血清白蛋白作用的熒光光譜[J].光譜學與光譜分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，劉永明，虢新運，等.熒光法研究鹽酸拓撲替康、鹽酸依利替康喜樹堿類藥物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化學學報， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黃 艷，賀 群.銥（Ⅳ）離子與人血丙種球蛋白的作用研究[J].化學學報，2005，63（3）：223-228.

[6] 張朝紅，臧樹良，耿 兵.三苯基錫化合物與牛血清白蛋白作用光譜[J].應用化學，2005，22（5）：489-493.

[7] 馮玉英，吳曉紅，周家宏.竹紅菌甲素與血紅蛋白相互作用光譜[J].應用化學，2005，22（8）：895-898.

[8] 劉 媛，謝孟峽，康 娟.三七總皂甙對牛血清白蛋白溶液構象的影響[J].化學學報，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之寧，陰永光，等.紫外光譜研究中藥大黃有效成分與牛血清白蛋白的相互作用[J].中國現代應用藥學雜志，2004，21（6）： 429-432.

（責任編輯 程碧軍）endprint

比較4種抗生素的結構（圖1）可知，CDR結構中含有羧基，容易解離，當CDR的濃度逐漸升高時，離子誘導BSA分子發生類似于降低pH所出現的蛋白質肽鏈伸展現象[5]，使包圍在BSA分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來，從而使278.0 nm吸收峰的吸收增強，同時使疏水基團之間的疏水作用增強、吸收峰紅移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多個羥基與BSA肽鏈中的氨基酸殘基中的含氧或含氮基團之間可形成氫鍵，從而使氨基酸殘基中含氧或含氮基團原有的鍵強減弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC與BSA的結合反應

紫外吸收光譜可以用來測定藥物分子與蛋白質的結合常數，藥物分子與蛋白質的結合可以表示為[8]：

2.3 BSA對CDR紫外吸收光譜的影響

為了進一步了解4種抗生素與BSA的相互作用信息，現以各抗生素為基體，研究BSA對其紫外光譜的影響。由于RM、CLMC與BSA本身的吸收峰有部分重疊，其相互作用的研究受到干擾；而KLMC在紫外吸收區沒有吸收峰；故本研究僅考察BSA對CDR藥物分子紫外吸收光譜的影響。

在所選擇的試驗研究條件下，CDR在紫外區的3個吸收峰分別為203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。試驗研究表明，BSA與CDR發生相互作用在286.0 nm表現最為明顯，所以選擇286.0 nm處的吸收峰為主要研究對象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，隨著加入BSA濃度的增加，CDR的吸收呈現明顯的增色效應，最大吸收峰位藍移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*躍遷引起，因此表明BSA與CDR的C=O有明顯的相互作用，但更具體的位置有待進一步研究。

根據Scatchard模型方程[9]，以ΔA對ΔA/CBSA作圖，由擬合直線的斜率可以求得結合常數KA。CDR能滿足Scatchard擬合，其擬合的線性程度較好（圖5）。線性回歸方程為y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用結合常數為0.88×105 （mol/L）-1。與用Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得BSA與CDR的結合常數相符。

3 小結

本研究利用紫外吸收光譜詳細研究了BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。結果表明，BSA與CDR、CLMC、RM和KLMC均發生了結合作用；CDR與BSA之間存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC與BSA之間主要通過氫鍵作用結合，并由Lineweaver-Burk雙倒數曲線求得CDR、CLMC、RM和KLMC與BSA的結合常數分別為：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同時以CDR為基體，研究BSA對CDR紫外光譜的影響，用Scatchard 擬合法求得結合常數為0.88×105 L/mol，兩種方法結果接近。

參考文獻：

[1] 田 媛，陳艷華，畢淑云，等.表面等離子體子共振傳感器研究頭孢菌素類藥物與白蛋白的相互作用[J].分析化學，2006，34（7）：967-970.

[2] 劉家琴，田建裊，謝建平，等.厚樸酚與人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化學，2006，34（3）：557-560.

[3] 陳曉波，康棟國，李 崧，等.利福平與人血清白蛋白作用的熒光光譜[J].光譜學與光譜分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，劉永明，虢新運，等.熒光法研究鹽酸拓撲替康、鹽酸依利替康喜樹堿類藥物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化學學報， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黃 艷，賀 群.銥（Ⅳ）離子與人血丙種球蛋白的作用研究[J].化學學報，2005，63（3）：223-228.

[6] 張朝紅，臧樹良，耿 兵.三苯基錫化合物與牛血清白蛋白作用光譜[J].應用化學，2005，22（5）：489-493.

[7] 馮玉英，吳曉紅，周家宏.竹紅菌甲素與血紅蛋白相互作用光譜[J].應用化學，2005，22（8）：895-898.

[8] 劉 媛，謝孟峽，康 娟.三七總皂甙對牛血清白蛋白溶液構象的影響[J].化學學報，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之寧，陰永光，等.紫外光譜研究中藥大黃有效成分與牛血清白蛋白的相互作用[J].中國現代應用藥學雜志，2004，21（6）： 429-432.

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