馬昆德擬青霉菌株產(chǎn)維生素A和維生素E的優(yōu)化

王波　韓燕峰　張延威

摘要：為進(jìn)一步提高一株馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）菌株維生素A和維生素E的產(chǎn)量，以PDA液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)方法，比較了添加氮源、pH及Fe2+添加對菌株產(chǎn)維生素A及維生素E的影響。結(jié)果表明，添加氮源為硝酸鈉，pH為6，不添加Fe2+，菌株維生素A含量明顯提高；添加氮源為蛋白胨，有助于提高菌絲維生素E含量。

關(guān)鍵詞：馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）；維生素A；維生素E；PDA培養(yǎng)基

中圖分類號： Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3893-02

Abstract： To further improve the yield of vitamin A and vitamin E from a Paecilomyces marquandii strain， effects of adding nitrogen source， pH value and Fe2+ to the strain producing VA and VE were compared with the orthogonal experiment using PDA liquid medium as the basic medium. The results showed that VA content of the mycelium increased obviously when adding nitrogen source as sodium nitrate， pH 6 and the basic medium without the addition of Fe2+. Peptone as the adding nitrogen source could help to increase VE content. PDA medium as basic medium was more conducive to the strain producing VA.

Key words： Paecilomyces marquandii； vitamin A； vitamin E； medium optimization

馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）為擬青霉屬孢子真菌。目前對馬昆德擬青霉的關(guān)注并不多，在污染消除、產(chǎn)物代謝、生物防治等方面有少量文獻(xiàn)報(bào)道。Slaba等[1-3]研究了馬昆德擬青霉菌株對鋅離子和鉛離子的吸附作用和機(jī)制，以及對除草劑甲草胺的降解并提出了其對甲草胺轉(zhuǎn)化的途徑，表明馬昆德擬青霉在消除鋅離子和甲草胺污染方面具有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景；Ahuja等[4]從貧磷土壤中分離到一株具溶磷作用的真菌，經(jīng)鑒定為馬昆德擬青霉；Dosio等[5]從馬昆德擬青霉培養(yǎng)液中分離到一種9肽抗菌素，與單克隆抗體AR-3結(jié)合，具抗癌作用。陳莉[6]在篩選小麥禾谷胞囊線蟲病生防菌株時(shí)篩選到一株馬昆德擬青霉菌株（09F11），對胞囊線蟲的卵和幼蟲有寄生作用，對其二齡幼蟲具有毒殺作用，同時(shí)還能降低其卵的孵化率。

已有研究初步探討了培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件對一株分離自土壤中的馬昆德擬青霉菌株產(chǎn)天然維生素A、維生素E（以下簡稱VA、VE）的影響[7]。本試驗(yàn)進(jìn)一步對該菌株產(chǎn)天然VA及VE的培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，以期尋找更經(jīng)濟(jì)、便利的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 馬昆德擬青霉，由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所提供。

1.1.2 儀器與藥品試劑 Agilent熒光分光光度計(jì)；無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉和維生素C，均為國產(chǎn)分析純；60%硫酸；VA和VE標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 待測樣品培養(yǎng) 選用PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同的氮源（3 g/L）、pH以及微量元素Fe2+的添加 （0.01 g/L），正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，比較這些因素對該菌株產(chǎn)VA及VE的影響。同時(shí)設(shè)無處理的PDA培養(yǎng)基為空白對照組（試驗(yàn)組5）、前期試驗(yàn)中最佳產(chǎn)VA培養(yǎng)基和最佳產(chǎn)VE培養(yǎng)基分別作產(chǎn)VA和產(chǎn)VE的對照組（試驗(yàn)組6、7）。將菌種接于設(shè)計(jì)好的各組液體培養(yǎng)基中，26 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)25 d，取出菌絲，用濾紙吸干水分，待測。

1.2.2 樣品的處理 參考劉訊等[7]、闞健全[8]的方法對待測樣品進(jìn)行處理。

1.2.3 VA和VE的測定

1）VA熒光強(qiáng)度的測定。取樣品石油醚液用熒光分光光度計(jì)于λex 340 nm/λem 478 nm處測定熒光強(qiáng)度，同時(shí)測定空白液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的熒光強(qiáng)度。

2）VE熒光強(qiáng)度的測定。取上層石油醚液于λex 295 nm/λem 330 nm處測定熒光強(qiáng)度，同時(shí)測定空白液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的熒光強(qiáng)度。

3）含量計(jì)算。按照下列公式計(jì)算樣品中VA和VE的含量（μg/g）：

VA或VE含量=（R2-R0）S×100/W（R1-R0）（1-H ）

式中， R1為標(biāo)準(zhǔn)工作液的熒光強(qiáng)度，R2為樣品液的熒光強(qiáng)度，R0為空白液的熒光強(qiáng)度，S為標(biāo)準(zhǔn)工作液的最后濃度（μg/mL）（該試驗(yàn)中VA為15 μg/mL，VE為20 μg/mL），W為樣品重量（g），H為樣品的水分率（%）。

2 結(jié)果分析

2.1 VA和VE的含量測定結(jié)果

各試驗(yàn)組VA和VE的含量測定結(jié)果見表2。菌株在以3 g/L的硝酸鈉為氮源，pH為7，不添加Fe2+的培養(yǎng)基中產(chǎn)VA最多，為448.25 μg/g；在以3 g/L蛋白胨為氮源，pH為7，添加0.01 g/L Fe2+的培養(yǎng)基中產(chǎn)VE最多，為32.16 μg/g。endprint

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)極差分析（表3）可知，對于VA而言，氮源對其影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A2B2C2，即添加氮源為3 g/L硝酸鈉，pH 6，不添加Fe2+；對于VE而言，氮源對VE含量影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A1B1C1，即添加氮源為蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析結(jié)果表明兩種氮源存在差異顯著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨為宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）無顯著差異。

3 討論

1）試驗(yàn)改進(jìn)了VA和VE的提取方法，采用室溫長時(shí)浸提，雖然提取時(shí)間加長，但相較水浴提取而言，操作上更加簡便，且在一定程度上避免了石油醚易揮發(fā)的影響。

2）以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加氮源對菌株VA和VE的含量影響較大。添加硝酸鈉，偏酸性培養(yǎng)條件有利于產(chǎn)VA，VA含量最高的試驗(yàn)組是空白對照組VA含量的近4倍，是最佳產(chǎn)VA對照組的近4倍，可知，通過添加成分進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，能較大幅度地提高菌株VA產(chǎn)量。對于菌株產(chǎn)VE而言，除氮源影響稍大外，pH和Fe2+的添加對VE產(chǎn)量的影響并不明顯，且優(yōu)化后VE產(chǎn)量最高的試驗(yàn)組相較空白對照組和產(chǎn)VE對照組提高并不多，優(yōu)化效果不明顯，推測可能與PDA培養(yǎng)基作基本培養(yǎng)基有關(guān)，與察氏培養(yǎng)基相比，PDA培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分更全面復(fù)雜一些；從試驗(yàn)中測得的VE的含量來看，比前期試驗(yàn)結(jié)果要低很多，推測其原因可能是提取劑和提取方法的影響。產(chǎn)VA和VE的最適添加氮源分別為硝酸鈉和蛋白胨。

參考文獻(xiàn)：

[1] SLABA M， SZEWCZYK R， PIATEK M A， et al. Alachlor oxidation by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013， 261（15）： 443-450.

[2] SLABA M， DLUGONSKI J. Efficient Zn2+ and Pb2+ uptake by filamentous fungus Paecilomyces marquandii with engagement of metal hydrocarbonates precipitation[J].International Biodeterioration & Biodegradation， 2011， 65（7）： 954-960.

[3] SLABA M， SZEWCZYK R， BERNAT P， et al. Simultaneous toxic action of zinc and alachlor resulted in enhancement of zinc uptake by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Science of the Total Environment， 2009， 407（13）： 4127-4133.

[4] AHUJA A， GHOSH S B， DSOUZA S F. Isolation of a starch utilizing，phosphate solubilizing fungus on buffered medium and its characterization[J]. Bioresource Technology， 2007， 98（17）： 3408-3411.

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[6] 陳 莉.小麥禾谷胞囊線蟲病生防菌株篩選及防病機(jī)理的初步研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[7] 劉 訊，董 利，豐曉雪，等.不同培養(yǎng)基成分對1株馬昆德擬青霉產(chǎn)天然VA及VE的影響[J]，貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：115-117.

[8] 闞健全.熒光法同時(shí)測定食品中維生素A和維生素E的含量[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1990，12（1）：46-51.endprint

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)極差分析（表3）可知，對于VA而言，氮源對其影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A2B2C2，即添加氮源為3 g/L硝酸鈉，pH 6，不添加Fe2+；對于VE而言，氮源對VE含量影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A1B1C1，即添加氮源為蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析結(jié)果表明兩種氮源存在差異顯著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨為宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）無顯著差異。

3 討論

1）試驗(yàn)改進(jìn)了VA和VE的提取方法，采用室溫長時(shí)浸提，雖然提取時(shí)間加長，但相較水浴提取而言，操作上更加簡便，且在一定程度上避免了石油醚易揮發(fā)的影響。

2）以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加氮源對菌株VA和VE的含量影響較大。添加硝酸鈉，偏酸性培養(yǎng)條件有利于產(chǎn)VA，VA含量最高的試驗(yàn)組是空白對照組VA含量的近4倍，是最佳產(chǎn)VA對照組的近4倍，可知，通過添加成分進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，能較大幅度地提高菌株VA產(chǎn)量。對于菌株產(chǎn)VE而言，除氮源影響稍大外，pH和Fe2+的添加對VE產(chǎn)量的影響并不明顯，且優(yōu)化后VE產(chǎn)量最高的試驗(yàn)組相較空白對照組和產(chǎn)VE對照組提高并不多，優(yōu)化效果不明顯，推測可能與PDA培養(yǎng)基作基本培養(yǎng)基有關(guān)，與察氏培養(yǎng)基相比，PDA培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分更全面復(fù)雜一些；從試驗(yàn)中測得的VE的含量來看，比前期試驗(yàn)結(jié)果要低很多，推測其原因可能是提取劑和提取方法的影響。產(chǎn)VA和VE的最適添加氮源分別為硝酸鈉和蛋白胨。

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[8] 闞健全.熒光法同時(shí)測定食品中維生素A和維生素E的含量[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1990，12（1）：46-51.endprint

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)極差分析（表3）可知，對于VA而言，氮源對其影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A2B2C2，即添加氮源為3 g/L硝酸鈉，pH 6，不添加Fe2+；對于VE而言，氮源對VE含量影響最大，其次為是否添加Fe2+，pH的影響最小；最佳組合為A1B1C1，即添加氮源為蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析結(jié)果表明兩種氮源存在差異顯著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨為宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）無顯著差異。

3 討論

1）試驗(yàn)改進(jìn)了VA和VE的提取方法，采用室溫長時(shí)浸提，雖然提取時(shí)間加長，但相較水浴提取而言，操作上更加簡便，且在一定程度上避免了石油醚易揮發(fā)的影響。

2）以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加氮源對菌株VA和VE的含量影響較大。添加硝酸鈉，偏酸性培養(yǎng)條件有利于產(chǎn)VA，VA含量最高的試驗(yàn)組是空白對照組VA含量的近4倍，是最佳產(chǎn)VA對照組的近4倍，可知，通過添加成分進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，能較大幅度地提高菌株VA產(chǎn)量。對于菌株產(chǎn)VE而言，除氮源影響稍大外，pH和Fe2+的添加對VE產(chǎn)量的影響并不明顯，且優(yōu)化后VE產(chǎn)量最高的試驗(yàn)組相較空白對照組和產(chǎn)VE對照組提高并不多，優(yōu)化效果不明顯，推測可能與PDA培養(yǎng)基作基本培養(yǎng)基有關(guān)，與察氏培養(yǎng)基相比，PDA培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分更全面復(fù)雜一些；從試驗(yàn)中測得的VE的含量來看，比前期試驗(yàn)結(jié)果要低很多，推測其原因可能是提取劑和提取方法的影響。產(chǎn)VA和VE的最適添加氮源分別為硝酸鈉和蛋白胨。

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[5] DOSIO F，RICCI M， BRUSA P，et al.Antibody-targeted leucinostatin A[J]. Journal of Controlled Release，1994，32（1）：37-44.

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[8] 闞健全.熒光法同時(shí)測定食品中維生素A和維生素E的含量[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1990，12（1）：46-51.endprint