燕麥組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

王迅婧　修謹　倪秀珍

摘要：燕麥（Avena sativa）組織培養(yǎng)體系的建立是通過遺傳轉化手段對燕麥進行品質改良的基本環(huán)節(jié)之一，以白燕10號裸燕麥為材料，對該品種燕麥組織培養(yǎng)中外植體的選擇、組織培養(yǎng)各階段所用激素及濃度進行了篩選研究。結果表明，成熟胚是較理想的外植體；誘導愈傷的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA；誘導分化的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.4 mg/L IAA。

關鍵詞：燕麥（Avena sativa）；組織培養(yǎng)；外植體；激素濃度

中圖分類號：Q819 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3936-03

Abstract： The construction of tissue culture system of oat is one of the basic aspects for improving quality with the transgenic method. The Baiyan 10# oat was used as material. The explants， hormone and hormone concentration were optimized for induction and differentiation of callus. The results showed that the mature embryo was the best explants for Baiyan 10# oat. MS+0.5 mg/L 2，4-D +0.1 mg/L NAA was the best culture for callus induction. MS+1.5 mg/L 6-BA +0.4 mg/L NAA +0.4 mg/L IAA was the optimal culture for differentiation of Baiyan 10# oat.

Key words：oat（Avena sativa）； tissue culture； explant； hormone concentration

燕麥（Avena sativa）是一年生禾本科植物，廣泛種植于北半球的溫帶地區(qū)，主要分為皮燕麥（帶稃型）和裸燕麥（裸粒型）兩種類型。裸燕麥是我國種植的主要品種[1]，裸燕麥子粒中含有多種維生素、不飽和脂肪酸和礦物質，并含有人體必需的8種氨基酸，可降低血脂、減少心腦血管等疾病發(fā)生的幾率，燕麥還具有抗旱、抗寒、耐貧瘠等特點，因此它常是治理鹽堿地區(qū)的先鋒植物[2，3]。在我國北方地區(qū)，氣溫和光照可以很好地滿足燕麥的生長需要，但是北方地區(qū)土壤的高鹽堿化及干旱缺水又限制了燕麥產(chǎn)量。利用植物基因工程技術改良燕麥能提高產(chǎn)量、增強抗旱和抗鹽堿能力，而遺傳轉化的關鍵是建立穩(wěn)定的植物組織培養(yǎng)體系。有關燕麥組織培養(yǎng)體系的研究已有不少報道，但相較于小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa L.）研究較少[4-10]。本研究以白燕10號裸燕麥為試驗材料，分別以燕麥種子、成熟胚、成熟胚和幼苗葉基為外植體，對誘導培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，皆在為燕麥愈傷組織的培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白燕10號由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學院惠贈；升汞、乙醇、MS、2，4-D、IAA、6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子的處理 燕麥種子用水沖洗2 h后，70%的乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次后用0.1% 的升汞浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次并浸泡15～20 min。將種子表面的水分用無菌濾紙吸干，并接種到MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃光照16 h，光照度8 000 lx，20 ℃暗培養(yǎng)8 h。

1.2.2 外植體的選擇 以燕麥種子、成熟胚、成熟胚的頂端分生組織和幼苗葉基作為外植體進行試驗，將不同外植體分別接種到相同的愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA）中，25 ℃光照16 h，光照度8 000 lx，20 ℃暗培養(yǎng)8 h，觀察愈傷組織誘導情況。

1.2.3 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的篩選 選擇出最適的外植體后，將其接種到4種愈傷組織誘導培養(yǎng)基（a.MS+0.5 mg/L 2，4-D +0.1 mg/L NAA；b.MS+0.5 mg/L 2，4-D；c.MS+4 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA[6]；d.MS+3 mg/L 2，4-D[9]）中，每個培養(yǎng)皿接25個外植體，4個重復。所有培養(yǎng)基中均加入3%的蔗糖和0.9%的瓊脂，25 ℃光照16 h，光照度8 000 lx，20 ℃暗培養(yǎng)8 h，觀察愈傷組織誘導情況，并記錄統(tǒng)計。

1.2.4 分化培養(yǎng)基的篩選 以6-BA、NAA、IAA為影響因素，以分化率為考察指標，采用L9（34）正交試驗，篩選最優(yōu)分化培養(yǎng)基，正交試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 白燕10號裸燕麥組織培養(yǎng)外植體選擇結果

取燕麥不同外植體置于培養(yǎng)基中（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA），選擇白燕10號最適外植體。經(jīng)過4周觀察，發(fā)現(xiàn)以種子為外植體在此種培養(yǎng)基上愈傷組織生長較慢，到4周后愈傷組織仍然很小，而且逐漸開始萎縮、死亡，接到分化培養(yǎng)基上后幾乎不分化；成熟胚產(chǎn)生愈傷組織誘導率高，約有95%的外植體產(chǎn)生愈傷組織，而且分化時間較早，分化率相對較高，達到50%左右；以葉基和胚頂端為外植體進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)雖然二者愈傷組織誘導率較高，但是愈傷組織開始分化時間較遲，而且能夠分化出燕麥苗的比例沒有成熟胚高，試驗結果如表3所示，成熟胚是白燕10號比較理想的外植體（以下試驗的外植體均采用成熟胚）。endprint

2.2 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的篩選結果

為了確定成熟胚誘導愈傷組織的最佳狀態(tài)，以成熟胚作為外植體，分別置于4種不同培養(yǎng)基上誘導愈傷組織（表3）。由表3可以看出，在a、b兩種培養(yǎng)基上愈傷組織形成較早，c、d兩種培養(yǎng)基誘導形成愈傷組織較晚，愈傷組織培養(yǎng)3周后雖然大小基本相同，但b、d培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色白、松軟而且水分較多，而a和c培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色微黃、結構緊密且水分少，有利于進一步分化（圖1）。本研究選擇a培養(yǎng)基作為誘導愈傷組織的培養(yǎng)基，即在MS培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L NAA。

2.3 白燕10號分化培養(yǎng)基的篩選

為了提高燕麥分化率得到相對健康的再生苗，以出苗率為考察指標，對6-BA、NAA及IAA 3種激素組合進行正交試驗，結果見表4。由表4可以看出，9種分化培養(yǎng)基均能使燕麥愈傷組織分化，但是不同培養(yǎng)基之間存在差異性，6-BA對分化影響最大，其次是IAA，最后是NAA。3號培養(yǎng)基對應的愈傷組織分化率最高，達到57.3%，培養(yǎng)基中激素組合是1.5 mg/L 6-BA、0.4 mg/L NAA、0.4 mg/L IAA，最佳培養(yǎng)基組合也是A1B3C3。因此，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.4 mg/L IAA為誘導白燕10號成熟胚愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基。采用最佳分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)的白燕10號再生苗如圖2所示。

3 小結與討論

不同植物以及同類植物的不同品種在進行組織培養(yǎng)過程中涉及的因素均有差異，如外植體的選擇、激素的選擇及配比等都會影響結果。本研究以白燕10號為材料，首先對外植體進行了選擇，結果表明，成熟胚是白燕10號最適外植體，以白燕10號成熟胚作為外植體在4種不同培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，其中MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA的激素配比所誘導愈傷組織結構緊實、顏色微黃適于誘導分化苗。一般認為6-BA是禾本科作物綠苗分化的主要細胞分裂素，在燕麥分化過程中是必不可少的激素，在誘導愈傷組織進行分化的培養(yǎng)中6-BA的極差最大，表明6-BA是影響燕麥分化的關鍵條件，3種激素對燕麥愈傷組織分化的作用不同，6-BA影響最大，NAA影響最小。正交試驗結果表明， MS+ 1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA +IAA 0.4 mg/L為最佳培養(yǎng)基，能夠較好地誘導白燕10號愈傷組織產(chǎn)生再生苗。

參考文獻：

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