高效液相色譜法測(cè)定斷血流中香蜂草苷的含量

黃毅 袁小紅 劉卓

摘要 [目的]建立測(cè)定斷血流中的香蜂草苷含量的方法，考察不同產(chǎn)地?cái)嘌髦邢惴洳蒈盏暮俊方法]采用Zorbax Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），柱溫25 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（48∶52），流速0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm。建立了高效液相色譜法測(cè)定斷血流中香蜂草苷的含量。[結(jié)果]香蜂草苷在20.84～104.20 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 4），平均加樣回收率（n=9）為98.63%（RSD=2.57%）。[結(jié)論]所建方法快捷簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為斷血流中香蜂草苷含量檢測(cè)的方法。

關(guān)鍵詞 斷血流；香蜂草苷；含量；高效液相色譜法

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10907-02

HPLC Determination of Didymin in Duanxueliu Herb

HUANG Yi1，2，YUAN Xiaohong1，LIU Zhuo1 （1.School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010； 2.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065）

Abstract [Objective] To establish a method by DADHPLC for determining the content of didymin in Duanxueliu herb from different habitats.[Method] Zorbax Eclipse XDB C18 chromatographic column（4.6 mm×150 mm，5.0 μm） and methanolwater（48∶52） as mobile phase were comployed，at a flow rate of 0.8 ml/min，a detecting wavelength at 285 nm.[Result] The standard curve of didymin was linear in the range of 20.84-104.2 μg/ml（r=0.999 4）.The average recovery of didymin was 98.63% with the RSD of 2.57% （n=9）.[Conclusion] This method is rapid，simple，sensitive，reliable，accurate and suitable for the analysis and determination of didymin in Duanxueliu herb.

Key words Duanxueliu herb； Didymin； Content； HPLC

斷血流為唇形科植物蔭風(fēng)輪Clinopodium polycephalum （Vaniot）C.Y.Wu et Hsuan 或風(fēng)輪菜Clinopodium chinensis（Benth.）O.Kuntze 的干燥地上部分，具有收斂止血之功效，主要用于治療崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血等出血癥及單純性紫癜、原發(fā)性血小板減少性紫癜等癥^[1]。中國(guó)藥典2010版一部中將醉魚草皂苷IVb作為其主要活性成分進(jìn)行鑒別檢測(cè)^[2]。除醉魚草皂苷外，斷血流中還含有多種活性成分，主要是黃酮及其苷、三萜及其苷類以及環(huán)烯醚萜苷類等。近年來，其中的黃酮苷——香蜂草苷開始引起大家的研究熱情。香蜂草苷最早由Wagner等于1967年在同科美國(guó)薄荷屬（Monarda）植物美國(guó)薄荷（Monarda didyma）的葉中發(fā)現(xiàn)^[3]，戴金瑞在1983年首次從風(fēng)輪菜中分離并鑒定該化合物^[4]，陳靖宇等1997年首次從蔭風(fēng)輪中分離并鑒定該化合物（圖1）^[5]。最新的藥理研究發(fā)現(xiàn)香蜂草苷可通過抑制癌基因 N-Myc 以及上調(diào)Raf激酶抑制蛋白（RKIP）誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡^[6]，使其可能成為一個(gè)非常有潛力的治療神經(jīng)細(xì)胞瘤的先導(dǎo)化合物。同時(shí)，該化合物也顯示出了對(duì)非小細(xì)胞肺癌有一定的治療效果^[7]。作為一個(gè)有開發(fā)潛力的候選化合物，目前尚無其含量測(cè)定方法。該研究采用反相高效液相色譜法對(duì)斷血流中香蜂草苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器 美國(guó) Agilent 1260型高效液相色譜儀：包括DAD檢測(cè)器、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、安捷倫化學(xué)工作站；賽多利斯Acculab Alc電子天平；KS120E超聲波清洗機(jī)；上海亞榮RE201D旋蒸蒸發(fā)儀等。

1.2 試藥 香蜂草苷對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，HPLC檢測(cè)為單峰，采用歸一化法計(jì)算其純度>98%）；斷血流藥材于2012年5月購自湖北和安徽金寨；甲醇為色譜純（美國(guó)FISHER公司），超純水由實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置。

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備。精密稱取香蜂草苷對(duì)照品5.21 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解、定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得對(duì)照品溶液，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 供試品溶液的制備。精密稱取斷血流藥材粗粉5 g，置于圓底燒瓶中，加入300 ml 80%乙醇，80 ℃回流提取3 h，抽濾后，旋干溶液，用甲醇定容至20 ml容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

1.3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水（48∶52），流速0.8 ml/min，柱溫25 ℃；利用DAD檢測(cè)器在190～400 nm對(duì)對(duì)照品進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定樣品測(cè)定的最大吸收峰位置。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。對(duì)照品溶液按比例配制為6個(gè)濃度（20.84、41.68、52.10、62.52、83.36、104.20 μg/ml），按照“1.3.2”色譜條件測(cè)定，每次進(jìn)樣5 μl，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度試驗(yàn)。精密稱取“1.3.1.1”制備的對(duì)照品溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各次峰面積，計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取6份同批斷血流藥材，按照“1.3.1.2”項(xiàng)的方法平行制備供試品溶液6份，測(cè)定各份藥材中香蜂草苷的含量，并計(jì)算RSD，要求該值小于3%。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取重復(fù)性試驗(yàn)中6份樣品，放置0、2、4、8、10、12 h后，各精密進(jìn)樣5 μl，測(cè)定測(cè)定香蜂草苷的峰面積并計(jì)算RSD值。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn)。分別精密吸取對(duì)照品溶液（另配，429 μg/ml）3.0、3.5、4.0 ml各3份，加入到500 mg原藥材粉末中，照“1.3.1.2”方法操作，測(cè)得香蜂草苷含量，計(jì)算加樣回收率和RSD。

1.3.8 樣品含量測(cè)定。取不同產(chǎn)地的斷血流藥材，按照“1.3.1.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，按照“1.3.2”項(xiàng)的色譜條件，測(cè)得兩地藥材中香蜂草苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 由對(duì)照品在190～400 nm的波長(zhǎng)掃描結(jié)果（圖2）可見，香蜂草苷在190、215、228和285 nm處有較大紫外吸收，鑒于有機(jī)化合物在232 nm以下干擾重的原因，在此選定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。在該檢測(cè)波長(zhǎng)及相應(yīng)色譜條件下，繪制對(duì)照品及供試樣品色譜圖（圖3）。由圖3可見，對(duì)照品及供試品溶液中的香蜂草苷保留時(shí)間均為9.3 min，樣品所測(cè)定主峰旁邊無明顯雜峰，經(jīng)計(jì)算樣品與其他組分峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按香蜂草苷計(jì)均不低于4 000，符合藥典測(cè)定要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過以上色譜條件定量

測(cè)定對(duì)照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理，得香蜂草苷的回歸

方程為Y=3.385x+0.154（r=0.999 4），表明香蜂草苷在濃度20.84～104.20 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 重復(fù)進(jìn)樣6次，定量測(cè)定含量，計(jì)算RSD值為1.23%，表明精密度良好，符合含量測(cè)定要求。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 平行樣6份，定量測(cè)定含量，其平均含量為64 μg/ml，RSD值為1.02%，表明用此方法測(cè)定香蜂草苷含量，重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)中6份樣品，放置0、2、4、8、10、12 h后，各精密進(jìn)樣5 μl，測(cè)定香蜂草苷的峰面積，計(jì)算RSD值為1.3%，表明供試品溶液在12 h基本穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 由表1可見，香蜂草苷的平均加樣回收率為98.63%，RSD<2.57%，表明該方法回收率較好，方法可行。

3 討論

目前，斷血流的主要研究熱點(diǎn)還在其三萜皂苷類成分，藥典中也選擇醉魚草皂苷IVb作為指標(biāo)成分對(duì)斷血流藥材的質(zhì)量進(jìn)行考察，并且也只是采用薄層色譜進(jìn)行定性鑒定，無含量測(cè)定方法。部分文獻(xiàn)研究了以醉魚草皂苷IVb^[8-10]以及主要止血活性成分風(fēng)輪菜皂苷A^[11-13]作為質(zhì)控指標(biāo)的檢測(cè)方法。鑒于其黃酮苷可能成為未來抗癌藥物研究的熱點(diǎn)靶標(biāo)，筆者首次采用高效液相色譜法測(cè)定了斷血流中香蜂草苷的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，可推廣使用。

參考文獻(xiàn)

[1]

劉霞，徐玉春.斷血流的研究進(jìn)展[J].中草藥，2006，37（5）：801-803.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[S].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社，2010：306.

[3] WANGER H，HORHAMMER L，AURNHAMMER G，et al.Structure clarification and synthesis of didymin，an isosakuranetin7betarutinoside from Monarda didyma L.[J].Chemische Berichte，1968，101（2）：445-449.

[4] 戴金瑞.風(fēng)輪菜中香蜂草貳和橙皮貳的分離與鑒定[J].中草藥，1983，14（5）：1.

[5] 陳靖宇，陳建民，肖培根.蔭風(fēng)輪的化學(xué)成分研究（Ⅰ）[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9（3）：5-8.

[6] SINGHAL J，NAGAPRASHANTHA L D，VATSYAYAN R，et al.Didymin induces apoptosis by inhibiting N-Myc and upregulating RKIP in neuroblastoma[J].Cancer Prevention Research （Phila），2012，5（3）：473-483.

[7] HUNG J Y，HUS Y L，KO Y C，et al.Didymin，a dietary flavonoid glycoside from citrus fruits，induces Fasmediated apoptotic pathway in human nonsmallcell lung cancer cells in vitro and in vivo[J].Lung Cancer，2010，68（3）：366-374.

[8] 張雷，何兵.SPEHPLC測(cè)定斷血流片中醉魚草皂苷Ⅳb的含量[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007（17）：2534-2535.

[9] 何兵，田吉，李春紅，等.SPEHPLC測(cè)定斷血流膠囊中醉魚草皂苷Ⅳb的含量[J].藥物分析雜志，2008，28（8）：1316-1318.

[10] 陳月圓，李典鵬，盧鳳來，等.HPLCELSD法測(cè)定細(xì)風(fēng)輪菜中醉魚草苷Ⅳ的含量[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用， 2011（3）：22-25.

[11] 昝麗霞.HPLCELSD測(cè)定斷血流中的斷血流皂苷A[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（6）：677-678.

[12] 梁愛君，鄧英賢，張傳霞.HPLC法測(cè)定斷血流中斷血流皂苷A的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（3）：217-219.

[13] 陳華國(guó)，陳慶，靳鳳云.HPLC法測(cè)定斷血流中斷血流皂苷的含量[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，28（3）：62-63.