亞熱帶土壤氮素反硝化氣態產物研究

續勇波，蔡祖聰

1.云南農業大學煙草學院，云南 昆明 650201；2.南京師范大學地理科學學院，江蘇 南京 210097

反硝化是指將硝態氮或亞硝態氮還原成一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N2O）和氮氣（N2）的過程，是氮循環中重要的轉化過程和環節。反硝化作用的環境效應取決于其所產生的終產物，以及不同產物間的比例。通常認為反硝化作用的主要終產物是N2O和N2，NO并不是土壤或水體中反硝化作用的主要終產物。但這是基于溫帶恒電荷土壤的研究結果(Hofstra和Bouwman, 2005)。關于熱帶亞熱帶土壤反硝化過程中NO排放的研究甚少(Maljanen等, 2007)，因此，影響熱帶亞熱帶地區土壤反硝化產物的主要因素和機理尚不十分清楚。

熱帶亞熱帶土壤為可變電荷土壤，土壤的化學性質與溫帶地區恒電荷土壤有諸多不同特點(徐仁扣等, 2014)，如土壤高度風化、鐵鋁氧化物含量顯著高于溫帶地區土壤(Qafoku等，2004；Zhang等，2009)，土壤氧化還原勢較高(丁昌璞，2008)，酸性較強(Xu和Cai，2007)，為繼承性肥力較低的氧化土（Oxisols）和老成土（Ultisols）。越來越多的證據表明熱帶亞熱帶土壤反硝化具有一些與溫帶土壤不同的特征（Zhang等，2009 ;Xu和 Cai，2007; Zhang等，2010），然而還需要進一步深入研究造成熱帶亞熱帶土壤和溫帶土壤反硝化特性不同的原因和機理，這將有助于加深對熱帶亞熱帶環境條件下土壤 N循環的理解和認識。

在前期的研究工作中，我們對采集自亞熱帶不同成土母質和利用方式的45個土壤樣本，在密閉淹水厭氧培養試驗條件下，研究了亞熱帶土壤反硝化特性、影響因素和機理等（Xu和Cai，2007;Xu等，2012)，發現隨著培養時間的延長，排放到培養瓶上部空間的 N2O濃度逐漸上升，在第3～8天達到高峰，之后由于N2O被土壤進一步還原成為N2而逐漸降低(Xu等，2012)。那么在達到N2O濃度高峰之前是否存在N2O產生的前提物質——NO的大量產生？為此，我們進行了穩定性同位素15N示蹤試驗，用K15NO3替代前述試驗中的普通 KNO3，研究厭氧培養 1周內反硝化過程中的產物問題。

表1 供試土樣理化性質Table 1 Selected physico-chemical properties of the tested soils

1 材料和方法

1.1 供試土樣和試驗方法

供試土樣采自具有典型亞熱帶季風濕潤性氣候 特 點 的 江 西 省 （ 24°29'～30°04'N,113°34'～118°28'E）。由于受東南季風氣候的影響，本區氣候高溫多雨，干濕季季節明顯。根據近 30年氣象統計資料，其年平均降雨量為1785 mm，其中50%集中于4—6月，年平均溫度為18.4 ℃，最高月平均溫29.9 ℃出現于7月，無霜期為261 d，≥10 ℃的積溫為 5000～9500 ℃。土壤類型為低活性強酸土(Acrisols)和鐵鋁土(Ferralsols)（FAO，2001）。供試土樣選擇包括由3種成土母質(即第四紀紅土(Q)、第三紀紅砂巖(S)和花崗巖(G))和5種利用方式（即林地(F)、灌叢(B)、茶園(T)、旱地(U)和稻田(R)）組成的6個土壤類型組合，即SR、QR、QU、QB、GT、GF，采集0～20 cm新鮮土樣，風干1～3 d，以能通過2 mm篩為宜，置于4 ℃保存備用并立即開始試驗。供試土壤理化性質見表1。

試驗方法參照文獻（Xu和Cai，2007；Xu等，2012），為了測定同位素15N豐度，采用K15NO3替代普通 KNO3，試驗步驟和測試方法稍作改動，具體為稱取相當于 30 g烘干土質量的上述新鮮土裝入250 mL三角瓶中，加蒸餾水30mL，蓋上橡膠塞，于30 ℃下淹水預培養7 d，以便激活土壤微生物。同時測定培養瓶有效空間體積和土壤全氮、NH4+-N,NO3--N的質量分數，作為土壤背景值。預培養結束時，隨機選取3瓶測定土壤全氮、NH4+-N、NO3--N的質量分數，記做起始質量分數。

將三角瓶用帶采氣孔的特殊硅橡膠塞(硅橡膠塞中間打一小孔，內插玻璃管，管外套一段細硅橡膠管，其口用硅橡膠塞封口)蓋緊，并在瓶塞周圍涂抹704膠密封以防漏氣。從取樣口將三角瓶內抽成真空，通人氮氣，再抽成真空，如此反復3次，最后通入1個大氣壓的高純氮。用注射器加入5 mL(含6 mg NO3--N)硝酸鉀溶液(K15NO3, 10 atom%15N)(相當于200 mg·kg-1)，并用5 mL蒸餾水清洗1次，充分混合。最后將取樣口用704膠密封以保證厭氧培養環境，所有三角瓶置于 30 ℃下恒溫淹水厭氧培養。

分別在厭氧培養開始后的1、3、7 d采集20 mL氣樣3份，分別注入18 mL已抽成真空的貯氣瓶中，第1瓶供測定N2O體積分數，第2瓶供測定15N2豐度，第3瓶供測定15N2O豐度用，抽取氣樣前用注射器反復抽提瓶內氣體3次以混勻氣體。取完氣樣后按V(液)∶m(土)=4∶1 加入 3 mol·L-1KCl 80 mL(已加水量考慮在內，使最終濃度為2 mol·L-1，總體積為 120 mL)，于 25 ℃、250 r·min-1下震蕩 1 h，離心，定量濾紙過濾，收集濾液于塑料瓶中。

吸取一定體積的濾液于蒸餾裝置中，加入0.2 g氧化鎂蒸餾，以硫酸標準溶液滴定，測定餾出液中NH4+-N的質量分數；再加代氏合金蒸餾，轉化成銨鹽后, 硫酸標準溶液滴定，測定(NO3-+NO2-)-N總量。在測定完硝態氮和氨態氮質量分數的溶液中分別加入6滴硫酸溶液(3 mol·L-1)酸化，于80 ℃烘箱中濃縮至干，用同位素質譜儀分析豐度。

離心管中的土壤轉移到鋁盒中，放入 45 ℃烘箱中烘干，磨細過100目篩，稱取適量土樣于消煮管中，按土壤全氮開氏消煮法進行消煮、蒸餾、硫酸滴定，測定完全氮質量分數后，滴定過的餾出液同上述方法酸化，放入 80 ℃烘箱中濃縮至干，用同位素質譜儀分析土壤全氮中的15N豐度。同時測定土壤含水量。

1.2 計算公式

N2O氣體體積分數用裝有63Ni電子捕獲器(ECD)的氣相色譜儀 (Shimadzu GC-14B, 日本)測定。色譜柱為80/100目的Porapak Q填充柱，進樣口、檢測器以及填充柱的溫度分別為100 ℃、300 ℃和65 ℃。載氣為95%氬氣+5%甲烷，流速為40 mL·min-1。標準氣為日本國立農業環境研究所提供。溶解到水中的N2O體積分數經Bunsen常數校正(Tiedje, 1982)。

N2O累積排放量計算公式

式中：MN為N2O的累積排放量，以N2O-N計算，單位：mg·kg-1。ρ為標準狀態下N2O-N的密度，為1.25 kg·m-3；C為N2O氣體體積分數，為×10-6；Vg是培養瓶上部有效空間體積，單位是m3；Vl為液體體積，單位是m3；α為Bunsen校正系數，30 ℃時為0.472；W為培養瓶內的烘干土質量，單位是kg；t為測定氣體時的溫度(℃)。

N2體積分數由于試驗條件所限無法直接測定，通過下列公式計算得到。溶解到水中的 N2體積分數經Bunsen系數校正(Tiedje, 1982)。

在已知有效空間體積、加入的水體積、土樣質量，且充滿純氮氣的培養瓶中，N2累積排放量（mg·kg-1）可按下式計算：

式中：C為N2累積排放量，單位為mg·kg-1；1.13為30 ℃時的N2密度，單位為kg·m-3；Vg為培養瓶有效空間體積，單位為 m3；Vl為加入的水體積，單位為m3；a為Bunsen校正系數，30 ℃時為0.0136；W為土樣質量，單位為kg。

其中：C’為15N2累積排放量，單位為mg·kg-1，C為公式（2）計算得到的培養瓶中N2累積排放量，單位為mg·kg-1；A為測定得到的15N2豐度，單位為atom%。

本文中氣態氮產物的損失率是指占施入15N總量的體積分數（%），總氣態氮損失率的實測值是指測定和計算得到的N2O與N2損失率的總和；總氣態氮損失率的估計值為差減法計算得到，即總加入15N量減去土壤全氮、銨態氮和硝態氮中的15N的差值。

2 結果與分析

從表2中不同取樣時間觀測數據可以看出，隨培養時間延長，土壤15NO3-質量分數、15N2O和15N2累積排放量有明顯變化，而土壤全氮(Total15N)和15NH4+質量分數變化不大，表明該體系中發生的主要氮素轉化過程是反硝化。

不同土樣第1天的回收率都在95%以上(表2)，表明測定方法和計算方法無誤，誤差在允許范圍內。但隨著培養時間的推移，回收率逐漸下降，到第 7天回收率僅為 67.2%～93.3%，平均為(80.8±9.1)%。與之相對應的是15NO3-質量分數由于反硝化作用而隨培養時間逐漸減少。土壤總殘留的15NO3-質量分數和回收率之間存在顯著正相關關系(圖1)，r2＝0.917(p<0.001)，表明反硝化勢越低的土樣回收率越高。

15N2O和15N2累積排放量隨培養時間推移而逐漸增加，總氣態氮損失率的估計值和實測值都隨培養時間延長呈上升趨勢，兩者之間存在顯著正相關性(r2＝0.81，p<0.001)(圖2)。總氣態氮損失率的估計值顯著高于實測值(p<0.01)，兩者之差高達6.7%～32.8%，平均為(18.6±9.0)%，即這部分氣態氮損失占施入15N總量的18.6%。而N2O、N2分別占總施入氮量的(4.4±2.3%)、(2.0±1.2)%。

表2 不同土樣不同培養時間的回收率和氣態氮損失Table 2 The recovery rate and the gaseous nitrogen loss for different soils at different sampling time

3 討論

在用標準(NH4++NO3-)-N溶液對測定NO3--N和NH4+-N質量分數的氧化鎂-代氏合金(MgO-Devarda)蒸餾法所做的方法檢驗試驗結果表明，回收率均在97%以上。開氏消煮法也是成熟的土壤全氮測定方法，因此，土壤中氮的測定誤差不是造成反硝化試驗中總回收率低的主要原因。此外，氮化合物和N2的豐度測定方法以及 N2O體積分數的測定方法也都是成熟技術，N2累積排放量計算方法在理論上也是正確的。

盡管厭氧條件下加入的 NO3--N有可能通過非生物固定作用轉化成可溶性有機氮（DON），這一N轉化途徑在溫帶森林土壤中是氮循環的重要組成環節，但在氧化還原勢（Eh）較高的熱帶亞熱帶土壤中并非如此(Zhang等，2010)。因此在本試驗條件下這一轉化過程可忽略不計。

(N2+N2O)-15N實測值低于總氣態氮損失的估計值，原因之一可能是由于對N2O和N2的不完全回收。盡管計算N2O和N2產生量已包括了溶解在水中的N2O和N2量(Tiedje, 1982)，本實驗按文獻中的溶解系數計算得到的水中溶解的15N2O和15N2量分別占施入15N總量最高不到0.5%和0.01%，這雖然與 Buresh和 Austin(1988)提出的水中溶解的15N2O量占施入15N總量不到1%的結果相似，但有可能低估了N2O和N2產生量，因為土壤和土壤溶液均可被N2O和N2所飽和，其可溶解量可高達周圍空氣濃度的46倍(Kaplan等，1978)。此外，土壤也可吸附N2-15N和N2O-15N，據Lindau等（1988）報道，淹水土壤中加入15N尿素后的33 d中28%被土壤以N2-15N的形態截留，在無淋洗、徑流損失的情況下直接測定得到的(N2+N2O)-15N回收率在41%～73%。而Chen等（1998）認為施入15NO3-5 d后90%的氣態氮產物被土壤吸附和截留。因此，按文獻中的溶解系數計算得到的水中溶解的 N2O和N2的量可能低估了溶解到水中的N2O和N2的量，也意味著忽視了被土壤吸附和截留的N2O和N2數量，從而導致計算的N2O和N2產生量有可能低估了實際N2O和N2排放量。

由于本試驗條件的限制，NO累積排放量無法直接測定，但從本實驗結果計算，這部分氣態氮損失可能占到了總氣態氮損失的67.5%～78.6%，平均為(74.1±4.2)%；占施入15N總量的(18.6±9.0)%。NO濃度有可能對反硝化氣態產物的貢獻達到顯著水平，因此有必要對熱帶亞熱帶土壤反硝化產物 NO進行深入研究。

濕潤型熱帶亞熱帶土壤自養硝化作用和反硝化作用較溫帶地區低（Zhang等，2010a, 2009b；Xu和Cai，2007；Zhao等，2007）。有研究表明，在氣候因素、土壤特性、較快的氮循環速率等綜合作用下，熱帶亞熱帶森林土壤氣態氮氧化物損失較溫帶森林土壤高，且是全球最大的N2O和NO自然排放源（Davidson和 Kingerlee, 1997; Stehfest和Bouwman, 2006)。厭氧培養條件下，濕潤熱帶亞熱帶地區森林土壤反硝化過程中產生的NO占總氣態氮產物的比率和 N2O占總氣態氮產物的比率通常顯著高于溫帶森林土壤（Zhang等，2009；Parsons等，1993），Zhang等認為這和熱帶亞熱帶土壤氧化物含量顯著高于溫帶地區土壤（丁昌璞，2008）、較高的氧化還原勢抑制了土壤反硝化的進行，從而使得 NO和 N2O占總氣態氮產物的比率增加有關（Zhang等，2009），進一步證實本試驗供試亞熱帶土壤NO可能是反硝化的主要產物之一。

本試驗中添加的 NO3--N質量分數為 200 mg·kg-1，NO3-濃度也是影響反硝化產物的因素之一。通常認為高濃度的 NO3-或 NO2-會抑制 NO還原為N2O，即抑制N2O的產生，使NO排放量增加。如Luo等（1996）認為NO3--N質量分數>100 mg·kg-1會抑制N2O的產生。而有的學者認為NO3--N質量分數范圍在 10～30 mg·kg-1即足以抑制上述過程（Cho和Mills，1979）。通常在施肥后農田土壤NO3-濃度可達這一標準。由于電子競爭作用，高濃度的NO3-不僅抑制N2O還原酶的合成和活性，而且也能抑制NO還原酶和NO2-還原酶（Gaskell等，1981）。反硝化還原酶的合成存在依次滯后的現象，即酶合成的先后順序是NO3-還原酶、NO2-還原酶、NO還原酶和 N2O還原酶，而且當 NO3-濃度越高，合成滯后的時間越長，因此有NO、N2O的暫時積累，且NO、N2O的排放先于N2的排放（Holtan-Hartwig等，2000）。

反硝化菌的生長和酶的合成在含有豐富氧化物且氧化還原勢較高的濕潤型熱帶亞熱帶土壤上也可能會受到抑制（Zhang等，2009）。我們的研究結果也證實濕潤型亞熱帶土壤反硝化菌豐富度較低（Xu和 Cai，2007）。然而關于土壤氧化物如何直接影響反硝化微生物的生長、酶合成和活性有待于進一步研究。另外，濕潤熱帶亞熱帶土壤pH值較低，遠遠低于大多數反硝化菌生長和活性發揮的適宜pH值6～8范圍（Aulakh等，1992）。

已有大量證據表明 NO也可由化學反硝化產生，即厭氧條件下 Fe2＋和 NO3-或 NO2-發生化學反硝化產生Fe3＋和NO（Philips等，2003）。我國亞熱帶土壤中含有豐富的鐵氧化物（徐仁扣等，2014；Qafoku等，2004），其活性較高的部分為Fe參與反硝化創造了物質基礎，我們的試驗結果也證實了酸性亞熱帶土壤Fe2＋參與了NO3-反硝化過程（Xu和Cai，2007；Xu 等，2013）。

以上這些因素的綜合作用可能導致反硝化過程中N2O和N2排放量較低，而NO是反硝化的主要產物之一。這也可能是造成反硝化回收率低的原因之一。但是造成熱帶亞熱帶地區土壤和溫帶地區土壤反硝化氣態產物及不同產物間比例差異的因素和機理尚需進一步研究。

從我們以往的研究結果可知，亞熱帶土壤N2O產生速率較其被進一步還原的速率高（Xu等，2012），因此，我們有理由推測反硝化在厭氧培養開始的頭幾天時間里，相對于N2O還原潛勢較弱、N2O產生潛勢較大，N2O排放占主導地位的情況下，作為N2O生成前提物質的NO有可能大量累積。如果不能回收的那部分都以NO形式排放，本實驗中NO損失平均占總氣態氮損失的(74.1±4.2)%，而以N2O和 N2形態損失的氮素只分別占總氣態氮損失的(17.1±2.1)%、(8.7±4.8)%。NO在大氣中的活性很強，是形成酸雨和光化學煙霧的前提物質（Hou等，2000），其環境危害不容低估。

此外，反硝化氣態產物中NO和N2O總量占總氣態氮損失的91.3%，意味著在亞熱帶土壤氮素反硝化中NO可能是反硝化的主要終產物，而非對環境無害的N2，因此在亞熱帶土壤反硝化研究中使用乙炔抑制方法可能意義不大。這一推理可從王連峰（2003）以亞熱帶紅壤為材料所做的反硝化試驗結果中得到部分支持，即經淹水或濕潤(40%WHC)處理110 d的旱地紅砂土在100%WHC水分條件下培育5 d，乙炔的加入與否對土壤N2O累積排放量未造成顯著影響。

4 結論

1）亞熱帶土壤反硝化培養過程中隨培養時間推移，15N回收率逐漸下降，土樣反硝化作用強弱與回收率呈顯著負相關。

2）總氣態氮損失率的估計值和實測值都隨培養時間延長呈上升趨勢，兩者之間存在顯著正相關性。

3）根據15N示蹤試驗結果估計，厭氧培養 7天內反硝化作用產生的氣態產物中NO、N2O和N2分別占總氣態氮損失的74.1%、17.1%和8.7%。

4）反硝化作用產生的氣態產物中NO、N2O和N2分別占總施入氮量的18.6%、4.4%和2.0%。

5）亞熱帶土壤氮素反硝化過程中 N2O和 N2排放量較低，而NO是反硝化的主要氣體產物之一，其環境危害不容低估。

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