miR—26a抑制胃癌AGS細胞生長的分子機制

邵發保+++徐祝麗+++黃勤蘭

[摘要] 目的 檢測miR-26a在胃癌組織的表達改變，明確miR-26a調控胃癌細胞生長的分子機制。方法 運用qRT-PCR檢測71例胃癌及相應癌旁正常組織中miR-26a的表達改變；將miR-26a 模擬物轉染胃癌細胞AGS，采用Western blot檢測其對MTDH蛋白表達水平的影響；然后采用MTT法檢測高表達miR-26a對AGS細胞生長增殖的影響。結果 qRT-PCR檢測結果顯示，miR-26a在71例胃癌組織中表達下調0.44倍；Western blot結果顯示，過表達miR-26a或干擾MTDH可抑制MTDH蛋白的表達。MTT檢測發現，轉染MTDH siRNA和miR-26a 模擬物組AGS細胞從48 h起OD值分別為（0.158±0.006）、（0.201±0.006），與對照組細胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差異均有統計學意義（P<0.05）。 結論 miR-26a通過靶向調控MTDH的表達而抑制胃癌細胞的生長。

[關鍵詞] miR-26a；胃癌；生長增殖

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）26-0011-03

miRNAs 調控重要的生物學過程，包括發育、細胞增殖和凋亡、細胞分化、代謝等，并且在很多疾病中表達失調，包括腫瘤[1，2]。根據生物軟件的預測，每個miRNA可能調控上百個靶基因，大約調控人類1/3蛋白編碼基因的表達。目前，對miRNA的研究正逐步從基本的腫瘤分子研究走向臨床應用領域。miRNAs可作為一個潛在的生物標志物用于胃癌的診斷、預后、藥物反應以及易感性的預測等方面的潛能。研究表明，miR-26a在肝癌、鼻咽癌、胃癌以及乳腺癌組織和細胞中表達下調，且抑制腫瘤細胞的生長增殖[3-5]。但miR-26a在胃癌中的具體生物學功能并不清楚。本研究擬通過采用qRT-PCR、Western blot以及MTT法檢測miR-26a在胃癌中的生物學作用及作用機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料

收集2008年1月～2013年7月間我院收治且確診為胃癌的患者71例。中位年齡53（39～70）歲。病理診斷結果均經兩名以上病理科醫生確認。

1.2主要材料

miR-26a 模擬物及對照模擬物從Ambion公司購買。MTDH siRNA質粒從santa cruz公司購買。MTDH抗體和β-actin抗體購自santa cruz公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。PRIM1640培養基和胎牛血清為Gibco公司產品。MTS細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 Western blot

將miR-26a模擬物或MTDH siRNA質粒轉染AGS細胞，48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組取等量樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉，加入MTDH或GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL發光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性

取轉染后的AGS細胞，消化后接種細胞于96孔板中，每空5000個細胞，每組設6個復孔，置37℃、5% CO2培養箱中培養。在未接種細胞的孔中加入RPMI-1640培養基中作為調零孔。接種72 h后，每孔加20 μL MTS檢測試劑，37℃孵育2 h，用酶標儀測定492 nm波長吸光度值（OD492）。實驗重復3次。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及其相應癌旁組織中miR-26a表達水平分析

qRT-PCR結果顯示，miR-26a在71例胃癌組織中的表達為（0.49±0.11），在71例胃癌癌旁正常組織中表達為（1.12±0.20），兩者相比下調0.44倍，差異具有統計學意義（P =0.008）。

2.2 miR-26a對胃癌AGS細胞中MTDH蛋白表達的影響

研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因，為了明確miR-26a對胃癌AGS細胞MTDH的蛋白質表達的調控作用，將miR-26a 模擬物轉染胃癌AGS細胞，以轉染miR-26a-對照為陰性對照，轉染MTDH siRNA為陽性對照，轉染48 h后收集蛋白。Western blot檢測結果顯示，轉染miR-26a模擬物組和MTDH siRNA組MTDH蛋白表達水平較陰性對照組明顯降低（圖1）。結果提示，miR-26a能下調胃癌AGS細胞系中MTDH蛋白質的表達。

2.3 miR-26a對胃癌細胞增殖能力的影響

分別將miR-26a-模擬物，miR-26a-對照（陰性對照組）和MTDH siRNA以及siRNA-對照（陰性對照組）轉入AGS細胞24、48、72 h后，通過MTT法檢測其對細胞增殖活性的影響。結果顯示，轉染MTDH siRNA和miR-26a 模擬物組AGS細胞從48 h起OD值分別為（0.158±0.006）、（0.201±0.006），其增殖速度明顯減慢，與miR-26a 對照組細胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差異均有統計學意義（P<0.05），提示高表達miR-26a通過下調MTDH的表達，從而抑制胃癌AGS細胞的生長增殖。

3討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居第四位，死亡率居第二位[6]。其中，大約60%的胃癌患者發生在東亞（主要在中國）。在中國，大約2/3的胃癌患者發展成為晚期或轉移性癌癥，超過一半的患者在根治性手術后復發，而這些患者的生存期一般為6～9個月[7]。隨著生活水平的提高、內窺鏡的應用以及多模式的治療方案的實施，近幾十年來胃癌的發病率和死亡率有所下降，但是晚期胃癌的死亡率仍然居高不下。鑒于目前的狀況，有效地早期生物標志物的鑒定以及高效低毒藥物的開發成為當務之急。

胃癌的發生發展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學和分子生物學等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發生發展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發生發展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發展過程中的不同組織學類型和疾病發展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調。目前有關miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發現miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質細胞瘤中發現，是一個HIV誘導的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發生發展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發生的多種生物學過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調，并通過直接靶向調控MTDH的表達發揮生物學作用，我們將繼續深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統闡明miR-26a參與胃癌發生發展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

[參考文獻]

[1] Tang H，Deng M，Tang Y，et al. miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J]. Clin Cancer Res，2013，19（20）：5602-5612.

[2] Tang H，Kong Y，Guo J，et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Letters，2013，340（5）：72-81.

[3] Ji J，Shi J，Budhu A，et al. MicroRNA expression， survival， and response to interferon in liver cancer[J]. N Engl J Med，2009，361（5）：1437-1447.

[4] Lu J，He ML，Wang L，et al. miR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J]. Cancer Res，2011，71（1）：225-233.

[5] Gaedcke J，Grade M，Camps J，et al. The rectal cancer microRNAome-microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4919-4930.

[6] Guggenheim DE，Shah MA. Gastric cancer epidemiology and risk factors[J]. J Surg Oncol，2013，107（3）：230-236.

[7] Gao M，Yin H，Fei ZW. Clinical application of microRNA in gastric cancer in Eastern Asian area[J]. World J Gastroenterol，2013，19（13）：2019-2027.

[8] Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol，2010，11（1）：136-146.

[9] Gao J，Li L，Wu M，et al. miR-26a Inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One，2013，8（12）：e651

[10] Zhang B，Liu XX，He JR，et al. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32（1）：2-9.

[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的發生發展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學和分子生物學等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發生發展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發生發展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發展過程中的不同組織學類型和疾病發展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調。目前有關miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發現miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質細胞瘤中發現，是一個HIV誘導的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發生發展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發生的多種生物學過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調，并通過直接靶向調控MTDH的表達發揮生物學作用，我們將繼續深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統闡明miR-26a參與胃癌發生發展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

[參考文獻]

[1] Tang H，Deng M，Tang Y，et al. miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J]. Clin Cancer Res，2013，19（20）：5602-5612.

[2] Tang H，Kong Y，Guo J，et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Letters，2013，340（5）：72-81.

[3] Ji J，Shi J，Budhu A，et al. MicroRNA expression， survival， and response to interferon in liver cancer[J]. N Engl J Med，2009，361（5）：1437-1447.

[4] Lu J，He ML，Wang L，et al. miR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J]. Cancer Res，2011，71（1）：225-233.

[5] Gaedcke J，Grade M，Camps J，et al. The rectal cancer microRNAome-microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4919-4930.

[6] Guggenheim DE，Shah MA. Gastric cancer epidemiology and risk factors[J]. J Surg Oncol，2013，107（3）：230-236.

[7] Gao M，Yin H，Fei ZW. Clinical application of microRNA in gastric cancer in Eastern Asian area[J]. World J Gastroenterol，2013，19（13）：2019-2027.

[8] Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol，2010，11（1）：136-146.

[9] Gao J，Li L，Wu M，et al. miR-26a Inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One，2013，8（12）：e651

[10] Zhang B，Liu XX，He JR，et al. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32（1）：2-9.

[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的發生發展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學和分子生物學等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發生發展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發生發展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發展過程中的不同組織學類型和疾病發展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調。目前有關miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發現miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質細胞瘤中發現，是一個HIV誘導的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發生發展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發生的多種生物學過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調，并通過直接靶向調控MTDH的表達發揮生物學作用，我們將繼續深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統闡明miR-26a參與胃癌發生發展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

[參考文獻]

[1] Tang H，Deng M，Tang Y，et al. miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J]. Clin Cancer Res，2013，19（20）：5602-5612.

[2] Tang H，Kong Y，Guo J，et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Letters，2013，340（5）：72-81.

[3] Ji J，Shi J，Budhu A，et al. MicroRNA expression， survival， and response to interferon in liver cancer[J]. N Engl J Med，2009，361（5）：1437-1447.

[4] Lu J，He ML，Wang L，et al. miR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J]. Cancer Res，2011，71（1）：225-233.

[5] Gaedcke J，Grade M，Camps J，et al. The rectal cancer microRNAome-microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4919-4930.

[6] Guggenheim DE，Shah MA. Gastric cancer epidemiology and risk factors[J]. J Surg Oncol，2013，107（3）：230-236.

[7] Gao M，Yin H，Fei ZW. Clinical application of microRNA in gastric cancer in Eastern Asian area[J]. World J Gastroenterol，2013，19（13）：2019-2027.

[8] Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol，2010，11（1）：136-146.

[9] Gao J，Li L，Wu M，et al. miR-26a Inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One，2013，8（12）：e651

[10] Zhang B，Liu XX，He JR，et al. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32（1）：2-9.

[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）