農桿菌介導的旱稻遺傳轉化主要影響因素

李朝煒+馮丹+翟會青+劉梅+魏景芳

摘要：以旱稻品種鯤旱1號為材料，對農桿菌介導的遺傳轉化中愈傷組織的誘導、篩選、分化等的影響因素進行了研究。將PPA抗蟲基因和bar抗性基因成功導入旱稻愈傷組織，經過篩選和分化最終獲得了抗性植株。結果表明，改良的NB培養基適合于旱稻愈傷組織的誘導；當農桿菌濃度在OD600 nm為0.2～0.3，侵染時間為20 min時，轉化效果最好；用40 mg/L的PPT篩選30 d后，可以獲得抗性愈傷組織；將已篩選的抗性愈傷組織在預分化培養基上培養5～7 d能有效提高分化率。

關鍵詞：旱稻；農桿菌；遺傳轉化

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3482-05

Main Factors Affecting Upland Rice Transformation Mediated by

Agrobacterium tumefacien

LI Zhao-wei，FENG Dan，ZHAI Hui-qing，LIU Mei，WEI Jing-fang

（Department of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Abstract： Using the seeds of upland rice Kunhan No.1 as the experimental materials， the effects of main factors including induction of calli， selection， and regeneration on the upland rice transformation frequency were investigated. The PPA gene and bar resistance gene were successfully transformed into upland rice calli. The resistant plants were obtained by screening and differentiation. The results showed that the improved NB medium was the optimal medium for inducing upland rice calli. The suitable concentration of the Agrobacterium was between 0.2 and 0.3. The incursion time was 20 min. Resistant calli can be obtained after being screened in the selective medium with 40 mg/L PPT for 30 days. The resistant calli were pre-differentiated 5～7 days before differentiation. The differentiation frequency of calli could be increased.

Key words： upland rice； Agrobacterium tumefacien； genetic transformation

收稿日期：2014-03-20

基金項目：國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2011ZX08001-003）

作者簡介：李朝煒（1979-），女，河北衡水人，講師，博士，從事植物分子生物學和基因工程研究，（電話）0311-81668495（電子信箱）

lizhaowei79@163.com。

旱稻，也被稱作陸稻，是水稻的變異型。其耐旱性強，適于旱地、坡地等干旱生態環境下種植。其在形態、生理等方面與水稻有不少的差別，一般在干旱缺水的生長狀況下表現明顯。據統計，每生產500 kg旱稻稻谷，用水量則僅為水稻用水量的10%～20%。缺水是我國農業生產所面臨的嚴峻考驗之一[1]。此外，我國水資源時空分布不均勻，南方水資源較為充沛，而北方水資源不到全國總量的20%。特別是進入7月中下旬，大部分地區降雨開始明顯減少，而水稻此時處于抽穗灌漿的關鍵時期，用水需求量很大，同時現有選育和推廣的稻作品種普遍抗旱性不足，致使很多地區缺水的現狀已成為影響水稻產量的重要原因之一。因此大力推廣適于旱地種植的栽培稻即旱稻栽培種，能節約大量的農業用水，充分利用土地資源，降低生產成本，提高經濟效益[2]。此外，旱稻采用直播種植的方式，省去了育秧、插秧等環節，大大減輕稻農的田間勞動量，非常適用于目前國內農業勞動力短缺的現狀。

大力發展旱稻還可為培育優質稻類新品種打下基礎，而其關鍵是進行品種選育，獲得抗逆、優質、高產的旱稻品種。通過農桿菌介導法這一基因工程手段進行改良是稻類作物遺傳轉化的首選方式[3-8]。近年來，針對稻類作物遺傳轉化體系的研究絕大多數是以水稻為研究材料，而關于旱稻的研究報道則主要集中在雜交育種、抗旱性測定、生理指標測定、特定基因的標記定位、遺傳多樣性分析等方面[9，10]。由于兩者品種間的明顯遺傳差距，在愈傷組織誘導、抗性篩選、分化再生等方面的具體培養條件差別較大[11-13]。目前已報道的旱稻遺傳效率較低，且不同品種間轉化條件差別較大。本研究以高耐旱、大穗大粒型粳旱稻品種鯤旱1號的成熟種子為材料，研究農桿菌介導法轉化旱稻的體系中各個關鍵技術環節，為建立穩定高效的旱稻轉化體系，進一步獲得具有抗逆性強的高產優質轉基因旱稻奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 旱稻材料 旱稻品種鯤旱1號成熟胚誘導的胚性愈傷組織為受體材料。

1.1.2 質粒及菌株 pCAMBIA3301由中國農業科學院生物技術研究所提供。隨后將來自于掌葉半夏的凝集素基因PPA構建入該表達載體，賦予轉基因旱稻抗蟲的能力。篩選標記基因為bar（Biolaphos resistance gene），編碼膦絲菌素乙酰轉移酶（Phosphinothricin acetyl transferase，PAT），可對除草劑草丁膦的有效成分膦絲菌素（PPT）產生抗性。農桿菌菌株為AGL-1，由中國農業科學院生物技術研究所提供。

1.1.3 培養基 研究采用NB培養基（N6大量元素、B5微量元素、有機元素、鐵鹽）及MS培養基作為基本培養基，添加一定濃度的激素及適量谷氨酰胺、水解酪蛋白和麥芽糖等成分。具體培養基成分見表1。

1.2 方法

1.2.1 種子的滅菌 選取適量子粒飽滿、干凈無霉變的旱稻種子，脫去穎殼，放置在指形管中，先用清水洗兩遍，在超凈臺中加入適量75%的乙醇振蕩消毒1 min，然后棄去液體，再加入適量的0.1%升汞或者有效氯為5%的次氯酸鈉溶液和幾滴吐溫20。滅菌兩次，每次20 min，期間不斷振蕩。隨后棄去液體，用無菌水清洗5次，在三角瓶中浸泡20～30 min，再用無菌水清洗3～5次。將種子撈出，置于放有無菌濾紙的培養皿中吸干水分。

1.2.2 愈傷組織的誘導及繼代 待種子基本干燥之后，用滅菌的小勺或鑷子將種子均勻分布在不同成分的誘導培養基上，每一個培養皿放置15～20粒，用封口膜將培養皿封好，置于28 ℃培養箱中暗培養。培養3～4 d后可見愈傷組織明顯形成，培養至7～10 d時，愈傷組織長至綠豆粒大小，此時將長出的芽切去，再繼續培養20～22 d統計出愈率。

誘導愈傷暗培養約30 d左右，挑選顏色淡黃、質地致密，并且愈傷組織表面散落出直徑約1～2 mm的球形愈傷團塊，將其繼代到新鮮誘導培養基上，于28 ℃暗培養5～7 d。

1.2.3 侵染及共培養 取適量超低溫保存的帶有目的基因的農桿菌菌種涂布在YEP固體培養基上，28 ℃下暗培養48 h。將培養基表面長出的農桿菌輕輕刮下放入50 mL AAM液體培養基中，于28 ℃，200 r/min振蕩培養2～3 h。在繼代培養基中挑選出直徑為2～3 mm的狀態良好、松脆圓潤的愈傷組織，放入滅菌錐形瓶中，每個錐形瓶大約收集300塊。在搖瓶培養后的菌液中逐漸加入新的AAM培養基，調整OD600 nm為0.2～0.3，將菌液倒入收集好愈傷組織的錐形瓶中，室溫侵染20 min，期間不時輕搖。棄去菌液，將愈傷組織用無菌濾紙吸干，轉移至鋪有一層無菌濾紙的共培養培養基上，25 ℃暗培養3 d。

1.2.4 抗性愈傷的篩選 將共培養后的愈傷組織取出置于滅菌培養瓶中，用無菌水洗滌4～5次，每次充分搖動，然后加入含500 mg/L特美汀的NB液體培養基，室溫靜置10 min。棄去液體，倒入含500 mg/L特美汀與2.0 mg/L 2，4-D的NB液體培養基，封口后室溫80 r/min搖瓶培養1 h，棄去液體，將愈傷組織置于帶有無菌濾紙的培養皿中吸干水分并放置過夜。再將愈傷組織均勻放置在恢復培養基上，28 ℃暗培養5～7 d（恢復培養基是在NB基本培養基中加入2，4-D 2.0 mg/L）。將經過轉化的愈傷組織轉移到篩選培養基上，28 ℃暗培養，15 d后繼代一次，繼續篩選培養15-20 d。

1.2.5 預分化及分化 將經過篩選后新長出的抗性愈傷組織轉接到預分化培養基上，28 ℃暗培養5～7 d。隨后將其轉入分化培養基，28 ℃暗培養3 d后移至光下，28 ℃培養15 d后挑選新生的幼小嫩芽移至新的分化培養基，繼續培養15 d左右。

1.2.6 壯苗及生根 待新生幼苗長至2 cm左右時，移至生根培養基中，28 ℃光照培養3～4周，待誘導出根并且幼苗長至7～10 cm時，從培養基中取出，洗凈根部沾染的培養基，移至育秧盤中（營養土與蛭石按照3∶1混合），繼續培養10 d左右后即可移入溫室或大田。

1.2.7 數據分析

出愈率=（產生愈傷組織的種子個數/接種的種子個數）×100%

抗性愈傷率=（抗性愈傷數/供試愈傷數）×100%

分化率=（再生植株數/抗性愈傷數）×100%

再生率=（再生植株數/供試愈傷數）×100%

轉化率=（陽性轉基因苗數/供試愈傷數）×100%

1.2.8 轉基因旱稻植株的分子水平鑒定 采用CTAB法從抗性再生旱稻幼苗的新鮮葉片中提取基因組DNA，凝集素基因PPA正向引物為 5′-ATCTCAGGAACAGCGACTTCGAC-3′，反向引物為 5′-TGATGATGAGCTCGCCCTTGTG-3′，擴增的目的片段為 510 bp。PCR反應采用20 μL體系，具體為： 10×緩沖液2 μL，兩種引物各1 μL（終濃度為 1 pmol/L），基因組DNA 1 μL，2.5 mmol/L的dNTP1.6 μL（終濃度 200 μmol/L），Taq酶0.2 μL（1U），用無菌超純水補足體積至20 μL。PCR程序為：96 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后，產物用1%瓊脂糖凝膠80 V電泳進行檢測。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑對旱稻種子滅菌效果的影響

升汞與次氯酸鈉均是植物組織培養常用的消毒劑。本研究采用0.1%升汞和5%次氯酸鈉分別進行200粒種子的消毒，隨后接種于以NB培養基為基礎的愈傷誘導培養基中，一周后比較污染率和出愈率。結果顯示在消毒時間為10、20 min時，兩者處理后的種子污染率及出愈率差別不大。處理時間超過30 min時均能達到較好的消毒效果（表2）。但隨著處理時間的延長，升汞對植物組織的毒害作用逐漸增大，尤其是消毒時間達到30 min以上時，種子胚部明顯變黑，出愈率顯著降低。加之升汞粉末經吸入、食入或者經皮膚吸收均對人體有毒害作用，因此本研究采用次氯酸鈉處理40 min作為滅菌條件。

2.2 不同培養基成分對旱稻愈傷組織誘導效率的影響

本研究在旱稻愈傷組織培養階段采用NB和MS培養基作為基礎并加以優化。結果顯示，這兩種培養基均可在5～7 d開始誘導出愈傷組織，但對愈傷組織的誘導效率明顯不同，NB培養基的愈傷組織誘導效率明顯高于MS培養基，具體見表3。此外，這兩種培養基所誘導出的愈傷組織的狀態也有所不同。NB培養基上的愈傷組織呈淡黃色，較為整齊，顆粒致密且形態圓潤；MS培養基上的愈傷組織顏色較為暗淡，松散易碎，且容易褐化。因此，本研究以NB培養基為基礎并進行改良，比較了蔗糖和麥芽糖分別作為碳源以及是否添加脯氨酸時愈傷組織的生長狀態。結果顯示，當以蔗糖為碳源并添加脯氨酸時，誘導出的愈傷組織顏色較深且容易褐化。當去掉脯氨酸并將碳源換為麥芽糖時，愈傷組織為淡黃色且狀態良好。

另外，還分別進行了2，4-D終濃度分別為2 、3 和4 mg/L的試驗，結果顯示隨著培養基中2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導效率略有上升但差異并不大，但較高濃度的2，4-D會使愈傷組織變得較為細碎，不適于后續的轉化試驗，因此在本研究中2，4-D的使用濃度為2 mg/L。

2.3 PPT對旱稻抗性愈傷組織的篩選條件

據以往文獻報道，粳稻的PPT篩選濃度較秈稻略高，一般秈稻的篩選濃度多為10～20 mg/L，而粳稻多為20～30 mg/L[5，14-16]。本研究所用的旱稻鯤旱1號為粳稻和爪哇稻遠緣雜交獲得，因此選擇20、30、40、50 mg/L等幾個濃度進行旱稻愈傷組織的除草劑耐受程度試驗，以確定適宜的PPT選擇濃度。

每種濃度分別接入100塊愈傷組織，27 ℃暗培養3～4周后統計愈傷組織的生長及存活狀況，之后將存活愈傷組織轉接入分化培養基，27 ℃光照條件下培養3周后統計能夠形成綠點的愈傷數，據此計算分化率。不同濃度PPT處理時愈傷組織的生長情況如表4。表4結果顯示，在不同濃度PPT處理時，愈傷組織生長速度均明顯減慢。PPT為30 mg/L和40 mg/L的培養基上，可明顯抑制未轉化愈傷組織的生長，存活率分別為29%和23%；PPT為50 mg/L的培養基上，愈傷組織生長狀態很差，絕大多數發生褐化死亡。結合分化率的數據，將選擇培養基中的PPT濃度設定為40 mg/L。

2.4 農桿菌的菌液濃度與侵染時間對旱稻抗性愈傷率和再生率的影響

研究表明，對于選用不同的受體品種和不同的農桿菌菌株，最適菌液濃度和侵染時間會有所差別。在本研究中對這兩個因素分別進行了摸索。首先采用相同的侵染時間，OD600 nm分別設定為0.1、0.2、0.3、0.4。隨后在相同的OD600 nm條件下，將侵染時間分別設定為10、20、30 min。每組試驗選取150塊愈傷組織，分別計算抗性愈傷率及分化率。具體結果見表5。

由表5可見， 在相同菌液濃度的條件下， 隨著侵染時間的延長， 抗性愈傷率逐漸升高。但當OD600 nm為0.4、處理時間達到20 min以及OD600 nm為0.3、處理時間達到30 min時，愈傷組織被過度侵染，在后續篩選階段殘留的農桿菌不易清除，極易造成污染導致無法統計數據。此外，當侵染時間達到40 min時，由于時間較長，對愈傷組織造成傷害使之活力下降，并且在共培養結束之后也不易抑菌，無法進行后續試驗，因此沒有作出相關數據的統計。

當OD600 nm為0.2或0.3，侵染時間為20 min時，抗性愈傷率及再生率較高且差別不大。而當OD600 nm為0.2，侵染30min時雖然抗性愈傷率較高，但由于侵染時間長對愈傷組織造成傷害較大，再生率并不高。因此選定OD600 nm為0.2～0.3，侵染時間20 min作為最適試驗條件。

2.5 預分化培養對旱稻分化率的影響

研究結果（表6）表明，將篩選得到的抗性愈傷組織在黑暗條件下進行5～7 d的預分化培養，再將其轉接至分化培養基。經過預分化的愈傷組織顏色為乳白色且富有光澤，在分化培養基上生長較快，狀態良好，分化率較高。而未經預分化的愈傷組織則顏色發黃且暗淡，生長緩慢，分化率較低且易褐化。主要原因在于預分化培養基中加入的脫落酸（ABA）具有促進植物細胞吸收營養和協調代謝的能力[17]，能夠調整愈傷組織的生理狀態，促進胚性愈傷組織發生，因此有利于提高分化率。

2.6 轉基因植物的PCR檢測分析

對農桿菌侵染轉化鯤旱1號獲得的T0代轉化植株進行了目的基因PPA的PCR檢測。大多數轉化植株中可特異地擴增出大小510 bp的目的基因片段，與陽性對照擴增結果完全相同（圖1）。同時以未轉化的植株提取基因組DNA作為對照，未擴增出目的片段。本研究共選取了300個狀態良好的愈傷團塊進行農桿菌侵染轉化，經篩選獲得203塊抗性愈傷，經分化得到46塊獨立的T0代轉化單株，經PCR檢測鑒定其中的38株含有目的基因PPA，轉化率為12.7%。

3 討論

3.1 旱稻愈傷組織的誘導條件

不同稻類的基因型差異是影響其轉化效率的重要因素[5]，究其根本，主要是受到愈傷組織的誘導效果以及分化與再生的難易程度的影響。在進行稻類基因轉化研究時，因其成熟種子取材不受季節限制、出愈率較高，且誘導出的胚性愈傷組織較易于分化再生，因此被作為愈傷組織的常用外植體來源。為獲得狀態良好的愈傷組織，本研究針對鯤旱1號胚性愈傷組織的適宜誘導培養基進行了摸索。結果顯示其在MS和NB培養基上均可形成愈傷組織，但以NB培養基為基礎進行誘導時的出愈率及狀態要好于MS培養基。

有研究顯示在誘導培養基中添加適量濃度的脯氨酸能夠增強愈傷組織的代謝活力，促進愈傷組織的生長[18，19]，但多應用于植物花藥和幼穗組織的愈傷組織誘導培養，且其具體作用原理尚不十分明確。而本研究發現當NB及MS培養基中添加一定濃度脯氨酸時，旱稻誘導形成的愈傷組織為土黃色，質地細碎干癟且容易褐化，而去掉脯氨酸后愈傷組織為淡黃色，顆粒致密，生長狀況良好，適于后續的遺傳轉化。

3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標記基因為bar基因，目前已成功應用于多種重要農作物的遺傳轉化。因其既可作為標記基因使用，在植物體內的表達產物又可作為非選擇性的除草劑，在農業生產中具有實用性，因此涉及的領域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉化體系均應摸索適宜的篩選濃度，對提高轉化率具有重要的意義。

試驗發現，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當培養基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉化的細胞能夠存活并分化成苗。當達到30～40 mg/L時，可使大部分非轉化細胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉化細胞能夠分化出苗。結合后續T0代轉化植株的PCR鑒定結果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達到82.6%。

3.3 農桿菌侵染條件對轉化效果的影響

采用農桿菌介導法進行植物組織基因轉化時，菌液濃度和浸染時間對轉化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農桿菌的有效細胞數目太少，或者有效地附著在愈傷團塊表面的農桿菌的量不足，都會導致轉化頻率降低。針對本研究采用的轉化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達到65%和20%以上。

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3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標記基因為bar基因，目前已成功應用于多種重要農作物的遺傳轉化。因其既可作為標記基因使用，在植物體內的表達產物又可作為非選擇性的除草劑，在農業生產中具有實用性，因此涉及的領域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉化體系均應摸索適宜的篩選濃度，對提高轉化率具有重要的意義。

試驗發現，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當培養基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉化的細胞能夠存活并分化成苗。當達到30～40 mg/L時，可使大部分非轉化細胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉化細胞能夠分化出苗。結合后續T0代轉化植株的PCR鑒定結果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達到82.6%。

3.3 農桿菌侵染條件對轉化效果的影響

采用農桿菌介導法進行植物組織基因轉化時，菌液濃度和浸染時間對轉化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農桿菌的有效細胞數目太少，或者有效地附著在愈傷團塊表面的農桿菌的量不足，都會導致轉化頻率降低。針對本研究采用的轉化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達到65%和20%以上。

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3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標記基因為bar基因，目前已成功應用于多種重要農作物的遺傳轉化。因其既可作為標記基因使用，在植物體內的表達產物又可作為非選擇性的除草劑，在農業生產中具有實用性，因此涉及的領域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉化體系均應摸索適宜的篩選濃度，對提高轉化率具有重要的意義。

試驗發現，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當培養基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉化的細胞能夠存活并分化成苗。當達到30～40 mg/L時，可使大部分非轉化細胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉化細胞能夠分化出苗。結合后續T0代轉化植株的PCR鑒定結果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達到82.6%。

3.3 農桿菌侵染條件對轉化效果的影響

采用農桿菌介導法進行植物組織基因轉化時，菌液濃度和浸染時間對轉化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農桿菌的有效細胞數目太少，或者有效地附著在愈傷團塊表面的農桿菌的量不足，都會導致轉化頻率降低。針對本研究采用的轉化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達到65%和20%以上。

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