金屬硫蛋白與糖尿病并發(fā)心肌病

邵雨田，牛超，阮丹丹，朱忠欣，金利泰，詹坤高

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金屬硫蛋白與糖尿病并發(fā)心肌病

邵雨田，牛超，阮丹丹，朱忠欣，金利泰，詹坤高

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院

糖尿?。―M）是當(dāng)今影響人口眾多，分布范圍廣泛的慢性疾病，糖尿病心肌病是其主要的并發(fā)癥之一。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率較非糖尿病患者高 2 ~ 3 倍。近期研究發(fā)現(xiàn)，血糖代謝正常者心力衰竭發(fā)病率為 3.2%，而糖代謝異常者（糖耐量減低和空腹血糖受損者）和 2 型糖尿病患者心力衰竭發(fā)病率分別是 6.0% 和 11.8%[1]。

1972 年，Ruber 將這種發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣化心臟病、心臟瓣膜及其他心臟病變來解釋的心肌疾病稱為糖尿病心肌病（DCM）[2]。隨著發(fā)病率的不斷增加，DCM 的治療已經(jīng)成為眾多臨床醫(yī)生和流行病學(xué)家亟待解決的問題之一。經(jīng)過四十多年的研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn) DCM 導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能、代謝途徑改變與氧化應(yīng)激增加、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體損傷等因素密切相關(guān)[3]。

考慮到金屬硫蛋白（MT）的功能和分子特性，尤其是其強大的金屬結(jié)合能力與自由基清除能力，利用金屬硫蛋白的抗氧化作用治療 DCM 已經(jīng)成為一種重要的策略[4]。金屬硫蛋白化學(xué)名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一類在生物界內(nèi)廣泛存在的小分子蛋白質(zhì)，具有獨特的分子特性，包括：①富含半胱氨酸，MT 的氨基酸組成中富含半胱氨酸，且每一個半胱氨酸都能與金屬相結(jié)合，使 MT 具有強大的自由基清除能力；②高金屬含量，可以幫助金屬離子的轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量代謝；③抗酸抗堿，在體內(nèi)體外環(huán)境中結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，不易變性；④低分子量，通過飲食攝入 MT，在消化道內(nèi)能完全被胃腸道吸收并以完整形式轉(zhuǎn)運到組織而不被分解為氨基酸或多肽；⑤高誘導(dǎo)性，可被金屬、糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子等應(yīng)激因素誘導(dǎo)合成；⑥分布范圍廣泛，動物、植物、微生物中均存在，且廣泛分布于各個組織中；⑦還具有光學(xué)特性、半保守性等特點[5-6]。目前，MT 在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測等方面都具有廣泛的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。

MT 在 DCM 中的作用機制尚不明確，目前普遍認(rèn)為與 MT 所具有的強大自由基清除能力、抗細(xì)胞凋亡功能以及與金屬結(jié)合能力等方面有關(guān)。隨著多種轉(zhuǎn)基因動物模型的開發(fā)利用，分離純化和檢測技術(shù)的改進(jìn)，MT 在 DCM 的臨床治療中頗具應(yīng)用潛力。

1 DCM 與金屬硫蛋白

糖尿病誘導(dǎo)的心肌病會損傷心臟結(jié)構(gòu)，使毛細(xì)管基底膜（CBM）增厚、間質(zhì)纖維化、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡、主動脈病變等；而且會影響心臟功能，使心臟收縮、舒張功能障礙，影響血液循環(huán)；此外，還會改變心臟代謝途徑，導(dǎo)致能量代謝異常從而對心臟造成嚴(yán)重的損傷。除高血糖、高血脂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAs）活化、心臟自主神經(jīng)病變外，這些現(xiàn)象與自由基水平升高、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、Akt 異常密切相關(guān)[3, 7]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MT 能夠通過減少氧化應(yīng)激，使活性氧自由基（ROS）水平下降；顯著減少心臟細(xì)胞凋亡、線粒體損傷；從而保護(hù)糖尿病初期內(nèi)皮損傷和毛細(xì)血管基底膜增厚及間質(zhì)纖維化等類似的結(jié)構(gòu)損傷[8]；并緩解心臟收縮舒張功能障礙，調(diào)節(jié)心臟鈣穩(wěn)態(tài)[9]，最終減少糖尿病導(dǎo)致的心臟損傷和腎損傷[10]。

2 MT 保護(hù) DCM 可能的分子機制

2.1 減輕氧化和硝化損傷

DCM 引起的高血糖、高血脂、胰島素抵抗會使 ROS 或活性氮自由基（RNS）水平失調(diào)致使心肌線粒體功能紊亂，一氧化氮合成酶偶聯(lián)抗氧化防御能力下降[11]，促使存活細(xì)胞信號受損和細(xì)胞凋亡[12]，進(jìn)而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重塑和功能衰竭[11]。并且，糖尿病還能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中超氧化物、3-硝基酪氨酸（3-NT）等物質(zhì)產(chǎn)生，升高體內(nèi) RNS 水平[13]，導(dǎo)致糖原合酶激酶（GSK-3β）失活進(jìn)而影響心臟糖代謝和能量代謝，引發(fā)炎癥等癥狀[14-15]。因而，DCM 的抗氧化治療和抗硝化損傷頗為重要。

相對于其他抗氧化劑來說，MT 作為心肌抗氧化劑具有以下優(yōu)點：①高效的自由基清除能力，MT 能夠高效清除氧自由基（·OH）、過氧陰離子（O2–）等氧化因子且清除能力比谷胱甘肽（GSH）的能力高 340 ~ 800 倍，且遠(yuǎn)高于過氧化物歧化酶（SOD）、維生素 C（VC）、維生素 E（VE）等其他抗氧化劑[16-17]；②非特異性，由于 MT 的抗氧化能力與其與金屬離子結(jié)合產(chǎn)生的動力不穩(wěn)定性有關(guān)，因而 MT 與親電物質(zhì)的結(jié)合不具有特異性，幾乎能清除所有氧化產(chǎn)物；③不產(chǎn)生新氧化物質(zhì)，MT 通過氧化還原循環(huán)消耗自由基，維持體內(nèi)氧化還原平衡；④靶向分布，MT 在心臟、肝臟、脾臟、胃腸道、腎臟等器官中都存在，然而在氧化應(yīng)激發(fā)生時會特異性過表達(dá)，在發(fā)生氧化應(yīng)激的部位富集，從而達(dá)到靶向分布的效果[18-19]；⑤安全性，MT 抗氧化過程中不影響心肌細(xì)胞正常功能表達(dá)[9]。

MT 的抗氧化應(yīng)激機制：一方面，表現(xiàn)為 MT 氧化還原循環(huán)（圖 1），當(dāng)環(huán)境氧化程度因為某些因素，例如谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例增加而減弱，即為低氧化水平時，Zn 結(jié)合 MT-硫醇生成 MT；隨著在 ROS 或 GSSG 存在下環(huán)境氧化程度增加，成為高氧化水平時，MT 在 Se 催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?MT-硫醇結(jié)合自由基，Zn 被釋放出來作用于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子。這種循環(huán)稱為 MT 的氧化還原循環(huán)，在維持機體的氧化還原平衡中起著重要作用[18-19]。另一方面，表現(xiàn)為誘導(dǎo)抗氧化有關(guān)的酶類產(chǎn)生。

圖1 MT 抗氧化應(yīng)激機制[18-19]

MT 抗心肌硝化損傷可能的機制：除清除 RNS 外，對比 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病 WT 鼠和 MT-TG 小鼠還發(fā)現(xiàn)由糖尿病誘導(dǎo)的心肌硝化損傷可能與琥珀酰輔酶 A：3-酮酸輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶-1（SCOT）硝化 Trp374有關(guān)[13]。其具體機制有待進(jìn)一步深入研究。

氧化應(yīng)激增加和硝化損傷都會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，目前主要以 3-NT 為心肌細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物[20]進(jìn)行研究，但也可能與 MAPKs 途徑或促分裂原激活蛋白激酶（CHOP）表達(dá)形式有關(guān)[21]。

2.2 維持金屬離子穩(wěn)態(tài)

除高糖損傷外，糖尿病還會導(dǎo)致心臟細(xì)胞金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡。MT 作為重金屬清道夫不僅能緩解金屬離子濃度過高造成的結(jié)構(gòu)損傷，還能通過參與金屬離子的轉(zhuǎn)運和代謝，促進(jìn)金屬離子穩(wěn)態(tài)。其中 Zn2+、Ca2+最為典型[10]。

此外，MT 的重金屬解毒作用還有助于解除 Cd2+、Cu2+等誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，對糖尿病心肌細(xì)胞起到了良好的保護(hù)作用。

2.3 降低心臟自噬作用

除了細(xì)胞凋亡和壞死外，最近研究發(fā)現(xiàn)心臟自噬是另一種 DCM 死亡的方式。在正常情況下，細(xì)胞自噬往往是一種保護(hù)性的應(yīng)激策略，而 DCM 會導(dǎo)致長期大量的過度自噬，這種情況往往是致命的。在心肌中的表現(xiàn)為通過抑制 PI3K(I)-Akt 信號通路使代謝失調(diào)[22]。而 MT 能夠影響自噬信號級聯(lián)使心臟自噬作用降低，從而減少心臟畸形[23]。

3 MT 研究現(xiàn)狀與臨床應(yīng)用展望

3.1 動物模型

目前研究MT 對 DCM 的抗氧化治療所采用的模型包括藥物注射模型和轉(zhuǎn)基因模型，主要的實驗動物是小鼠，其他還有兔、狗、豬等（表 1）。

表 1 常用動物模型[8]

以上模型的開發(fā)與應(yīng)用為 MT 治療 DCM 的研究階段提供了良好的實驗基礎(chǔ)。

3.2 MT 的誘導(dǎo)、檢測和分離純化

自 1957 年 Valee 發(fā)現(xiàn) MT 以來[24]，MT 的分離、鑒定、純化、檢測技術(shù)不斷成熟。目前主要采用分子生物學(xué)方法和生化分析方法（表 2）[25]。

MT 具有高誘導(dǎo)性，除了能夠通過如 Cu2+、Zn2+、Cd2+等金屬誘導(dǎo)，也能夠通過糖皮質(zhì)激素、胰高血糖素、腎上腺素等激素誘導(dǎo)，并且 CCl4、阿霉素、阿片類藥物、干擾素、細(xì)菌內(nèi)毒素等藥物也能夠誘導(dǎo)，還能夠通過高溫、寒冷等物理因素誘導(dǎo)。其誘導(dǎo)機制主要是通過應(yīng)激作用使 MT 富集。此外，轉(zhuǎn)基因也能夠使 MT 特異性過表達(dá)。

MT 的檢測方法多樣，主要包括生物化學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。其中，MT-mRNA 法采用 sqRT-PCR 或 RT-PCR 技術(shù)，操作簡便，檢測速度快，準(zhǔn)確度高；而電化學(xué)法包括伏安法、計時電位法、極譜法（除靈敏度高外還有助于研究 MT 構(gòu)型變化及其與金屬離子的相互關(guān)系）；在此基礎(chǔ)上，質(zhì)譜偶聯(lián)技術(shù)如 ESI-MS、MALDI-MS、ICP-MS 能夠進(jìn)一步研究蛋白特性；另外，金屬飽和分析法、巰基顯色法、色譜法、免疫化學(xué)法等也能用于 MT 的測定。在免疫化學(xué)法中，目前 FIA 使用較少，而 RIA 由于檢測時間長，準(zhǔn)確度較低，需要同位素標(biāo)記，而逐漸被 ELISA 所替代。免疫印跡法也有助于檢測低含量樣品。

色譜法包括 HPLC、HPLC-AAS，除檢測外還能用于 MT 的分離純化，其他的分離純化方法還包括層析法、凝膠過濾法等。

表 2 MT 誘導(dǎo)、檢測、分離純化方法

雖然，目前 MT 的檢測方法還缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果的適當(dāng)解釋也有待于進(jìn)一步的探討。但是隨著 MT 誘導(dǎo)、檢測、分離純化技術(shù)的不斷改進(jìn)，MT 緩解 DCM 及 MT 在人體內(nèi)的代謝方式將更清晰地展現(xiàn)出來。

3.3 給藥方式

由于 MT 獨特的分子特性，其治療糖尿病的給藥方式主要分為外源性給藥和內(nèi)源性給藥兩種。

外源性給藥，主要通過口服攝入。一方面，不同于胰島素，MT 具有分子量小、抗酸抗堿等分子特性，使其在動物體內(nèi)能夠直接被胃腸道吸收并以完整形式轉(zhuǎn)運到組織，而不分解為氨基酸或多肽，通過口服給藥以減少注射帶來的疼痛和麻煩，然而利用效率較低，往往到達(dá)心臟的含量很少。另一方面，通過轉(zhuǎn)錄激活因子（Tat）、線粒體蘋果酸脫氫酶（mMDH）中的短肽（sMTS）與 MT 融合而成的融合蛋白Tat-sMTS-MT（TMM）被證明能有效改善 DC 誘導(dǎo)的 H9C2 細(xì)胞缺氧、高糖、ROS 水平上升等癥狀，有望成為治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的治療蛋白，但其具體的作用機制和代謝方式尚不明確[26]。

內(nèi)源性給藥，主要是通過增加體內(nèi)Zn、糖皮質(zhì)激素或其他物質(zhì)的含量以誘導(dǎo) MT 的產(chǎn)生，從而使體內(nèi)MT 水平升高的方法。目前認(rèn)為 Zn 是較好的誘導(dǎo)物質(zhì)。一方面，Zn 是體內(nèi)所必需的微量元素之一，不僅能參與體內(nèi)的各種代謝調(diào)節(jié)，還是多種蛋白質(zhì)的組成成分。據(jù)報道，糖尿病患者往往出現(xiàn)缺鋅的癥狀，需要一定的外源性補充；另一方面，Zn 具有胰島素樣作用可以幫助調(diào)控血糖；并且 Zn 過量導(dǎo)致的毒副作用很小并能通過停止攝入緩解；此外 MT 的抗氧化作用依賴于 Zn 的參與[10]。

綜上所述，適當(dāng)?shù)慕o藥方式將大大增加 MT 在機體中的作用。因而找到一種高效（吸收效率高）、特異性（作用于靶器官心臟）、安全（毒副作用少）、便捷（使用時能盡量不給患者帶來痛苦）、經(jīng)濟（成本低廉）的給藥方式有待進(jìn)一步的探索。

4 小結(jié)

近年來，科研工作者通過組織水平觀察，細(xì)胞水平研究，分子水平分析對 MT 在 DCM 中的作用有了較為深入的認(rèn)識，然而由于 MT 具體的作用機制與代謝途徑尚不十分明確，充分認(rèn)識 MT 對 DCM 作用機制并投入臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究，如：在作用機制方面，MT 在分子水平上能夠減少氧化應(yīng)激與硝化應(yīng)激，但其具體過程反應(yīng)在組織水平中是否會與其他心臟代謝活動相互作用，這些作用進(jìn)一步會造成怎樣的影響，是否會影響其他器官的正常生理活動未有定論；在代謝途徑方面，MT 在體內(nèi)的代謝途徑仍不清晰，外源性給藥還是內(nèi)源性給藥頗有爭議；在分離純化、檢測技術(shù)方面，雖然隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，MT 的分離純化、檢測手段越來越多樣化，但仍未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和完善的方法。

這些問題有待于科研工作者們和醫(yī)學(xué)研究者們不斷深入地研究和不懈地堅持去發(fā)現(xiàn)、去解釋、去完善，以至于各個擊破。相信在不久的將來，隨著對 MT 治療 DCM 的作用機制的不斷認(rèn)識和 MT 在體內(nèi)的代謝途徑的更為清晰，以及 MT 的誘導(dǎo)、分離純化、檢測技術(shù)的日趨完善，MT 治療 DCM 不僅是一種頗具吸引力的策略，更能輔助臨床治療，減輕 DCM 患者的病痛。

[1] Thrainsdottir IS, Aspelund T, Thorgeirsson G, et al. The association between glucose abnormalities and heart failure in the population-based Reykjavik study. Diabetes Care, 2005, 28(3):612- 616.

[2] Rubler S, Dlugash J, Yuceoglu YZ, et al. New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis. Am J Cardiol, 1972, 30(6):595-602.

[3] Tarquini R, Lazzeri C, Pala L, et al. The diabetic cardiomyopathy. Acta Diabetol, 2011, 48(3):173-181.

[4] Vega-López S, Devaraj S, Jialal I. Oxidative stress and antioxidant supplementation in the management of diabetic cardiovascular disease. J Investig Med, 2004, 52(1):24-32.

[5] Va?ák M. Metallothioneins: chemical and biological challenges. J Biol Inorg Chem, 2011, 16(7):975-976.

[6] Haq F, Mahoney M, Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction. Mutat Res, 2003, 533(1):211-226.

[7] Boudina S, Abel ED. Diabetic cardiomyopathy, causes and effects. Rev Endocr Metab Disord, 2010, 11(1):31-39.

[8] Velic A, Laturnus D, Chhoun J, et al. Diabetic basement membrane thickening does not occur in myocardial capillaries of transgenic mice when metallothionein is overexpressed in cardiac myocytes. Anat Rec (Hoboken), 2013, 296(3):480-487.

[9] Hu N, Han X, Lane EK, et al. Cardiac-specific overexpression of metallothionein rescues against cigarette smoking exposure-induced myocardial contractile and mitochondrial damage. PLoS One, 2013, 8(2):e57151.

[10] Li B, Tan Y, Sun W, et al. The role of zinc in the prevention of diabetic cardiomyopathy and nephropathy. Toxicol Mech Methods, 2013, 23(1):27-33.

[11] Ansley DM, Wang B. Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart. J Pathol, 2013, 229(2):232-241.

[12] Zhou X, Lu X. The role of oxidative stress in high glucose-induced apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238(8):898-902.

[13] Cong W, Ma W, Zhao T, et al. Metallothionein prevents diabetes-induced cardiac pathological changes, likely via the inhibition of succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase-1 nitration at Trp(374). Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 304(8): E826-E835.

[14] Wang Y, Feng W, Xue W, et al. Inactivation of GSK-3beta by metallothionein prevents diabetes-related changes in cardiac energy metabolism, inflammation, nitrosative damage, and remodeling. Diabetes, 2009, 58(6):1391-1402.

[15] Xue W, Liu Y, Zhao J, et al. Activation of HIF-1 by metallothionein contributes to cardiac protection in the diabetic heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302(12):H2528-H2535.

[16] Park L, Min D, Kim H, et al. The combination of metallothionein and superoxide dismutase protects pancreatic β cells from oxidative damage. Diabetes Metab Res Rev, 2011, 27(8):802-808.

[17] Qu W, Pi J, Waalkes MP. Metallothionein blocks oxidative DNA damage in vitro. Arch Toxicol, 2013, 87(2):311-321.

[18] Ruttkay-Nedecky B, Nejdl L, Gumulec J, et al. The role of metallothionein in oxidative stress. Int J Mol Sci, 2013, 14(3):6044- 6066.

[19] Va?ák M, Meloni G. Chemistry and biology of mammalian metallothioneins. J Biol Inorg Chem, 2011, 16(7):1067-1078.

[20] Zhang YL, Wei JR. 3-nitrotyrosine, a biomarker for cardiomyocyte apoptosis induced by diabetic cardiomyopathy in a rat model. Mol Med Rep, 2013, 8(4):989-994.

[21] Miao X, Tong Z, Wang Y, et al. Metallothionein prevention of arsenic trioxide-induced cardiac cell death is associated with its inhibition of mitogen-activated protein kinases activation in vitro and in vivo. Toxicol Lett, 2013, 220(3):277-285.

[22] Mellor KM, Reichelt ME, Delbridge LM. Autophagic predisposition in the insulin resistant diabetic heart. Life Sci, 2012, 92(11):616-620.

[23] Jiang S, Guo R, Zhang Y, et al. Heavy metal scavenger metallothionein mitigates deep hypothermia-induced myocardial contractile anomalies: role of autophagy. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 304(1):E74-E86.

[24] Margoshes M, Vallee BL. A cadmium protein from equine kidney cortex. J Am Chem Soc, 1957, 79(17):4813-4814.

[25] Ryvolova M, Krizkova S, Adam V, et al. Analytical methods for metallothionein detection. Curr Anal Chem, 2011, 7(3):243-261.

[26] Lim KS, Lim MH, Won YW, et al. Dual-mode enhancement of metallothionein protein with cell transduction and retention peptide fusion. J Control Release, 2013, 171(2):193-200.

溫州醫(yī)科大學(xué)本?？茖W(xué)生科研課題（WYX201301037）；溫州市科技項目（Y20130156）

詹坤高，Email：zkg79512@163.com

2013-11-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.011