澤瀉醇提物及其萜類成分對擬南芥幼苗生長抑制作用的研究

付紹智+楊曉燕+燕志強+金輝+張等宏+秦波

摘要：以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）為受體，采用活體生物試驗方法測定澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]醇提物及其主要萜類活性成分對7日齡擬南芥幼苗生長的影響。結果表明，澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有較強的抑制作用，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗的生長表現出抑制作用，呈現較好的量效關系。而澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗的生長無明顯影響。研究證明澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有顯著的抑制作用，其中23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉潛在的化感活性成分。

關鍵詞：澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]；萜類化合物；擬南芥（Arabidopsis thaliana）；23-乙酰澤瀉醇B

中圖分類號：Q148.12 文章標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3556-04

Inhibitory Effects of the Ethanol Extract and Two Triterpenoids from Alisma orientalis on the Growth of Arabidopsis thaliana Seedling

FU Shao-zhi1， YANG Xiao-yan2， YAN Zhi-qiang2，JIN Hui2， ZHANG Deng-hong2， QIN Bo2

（1. Chongqing Three Gorges Medical College of traditional Chinese Medicine Research Institute， Chongqing 404120，China ；2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province， Lanzhou Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000，China）

Abstract： The inhibitory effects of the ethanol extract and two triterpenoids from Alisma orientalis on the 7-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana were studied and compared with bioassay methods.The results showed that the ethanol extract had significant inhibitory activity on the growth of Arabidopsis thaliana seedling 23-O-Acetylalisol B significantly reduced the fresh weight and root length of Arabidopsis thaliana seedlings， with a dose-dependent phytotoxic effect. Alisol A 24-acetate had no effect on the growth of Arabidopsis thaliana seedlings. The extract had a significant inhibitory effect on Alisma orientalis. 23-O-Acetylalisol B might be a potential allelopathic active substance of Alisma orientalis.

Key words：Alisma orientalis（Sam.） Juzep.； Triterpenoids； Arabidopsis thaliana； 23-O-Acetylalisl B

收稿日期：2014-01-10

基金項目：國家自然基金項目（31070386；21102154）；重慶市科技攻關項目（CSTC2011AC5140）

作者簡介：付紹智（1965-），男，重慶云陽人，副教授，碩士，主要從事藥用植物資源與生態學的研究，（電話）13896380613（電子信箱）fushaozhi@sina.com；

秦 波（1966-），男，甘肅鎮原人，研究員，博士，主要從事植物化學生態學的研究，（電話）0931-4968372（電子信箱）bqin@licp.cas.cn。

澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]為澤瀉科多年沼生草本植物，其干燥塊莖作為傳統常用中藥，具有利水滲濕的功效，主產于福建（建澤瀉）和四川（川澤瀉）等地，叢生于淺水或沼澤邊緣[1，2]。澤瀉含有多種萜類化合物，具有抗血栓、降血脂、利尿、抗脂肪肝、抗腎炎、促進免疫調節等多種藥理作用[3，4]。研究水生植物的毒活性物質、化感作用對水質凈化、水環境治理及生態文明建設具有重要意義[5，6]。迄今為止，對于長期生長在溫濕水環境下的澤瀉的化感作用和植物毒活性物質尚未見研究報道[7，8]。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗為活性試驗受體，對澤瀉醇提物和澤瀉體內主要活性成分23-乙酰澤瀉醇B及澤瀉醇A醋酸酯的植物毒活性作用進行研究，以期為澤瀉植物毒活性物質的發現及其資源的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 澤瀉醇提物制備 澤瀉采自重慶市梁平縣城北鄉兩路村，地下塊莖40 ℃低溫烘干，稱取100 g塊莖組織粉碎后用75%乙醇提取，提取液減壓濃縮，獲得澤瀉濃縮浸膏低溫保存待用。

1.1.2 受體植物 擬南芥Col野生型種子由蘭州大學生命科學院劉恒副教授實驗室提供。

1.1.3 澤瀉萜類成分 23-乙酰澤瀉醇B（CAS NO：26575-95-1）購自成都曼思特生物科技有限公司，澤瀉醇A醋酸酯（CAS NO：18674-16-3）購自上海永恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養 將擬南芥種子置于4 ℃冰箱避光放置3 d，70%乙醇表面消毒30 s，去離子水清洗3次，0.1%氯化汞表面消毒7 min，去離子水清洗6次，播于1/2 MS固體培養基上（直徑為9 cm的培養皿），置于光照培養箱中培養，培養光照強度為2 000 lx，光周期（L；D）為光16 h∶暗8 h，培養溫度22 ℃。

1.2.2 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗生長影響的測定 稱取澤瀉醇提物141.2 mg，加入甲醇溶解，配制成濃度為80 mg/mL的母液1.765 mL，經無菌濾膜過濾，用去離子水配制成4個濃度梯度（5、10、20、40 mg/mL）的處理溶液。在24孔板中每孔加入1/2 MS液體培養基990 μL及上述4個濃度的試驗樣品溶液各10 μL，于超凈工作臺中接種7日齡擬南芥幼苗，使試驗組的終濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL。置于恒溫光照搖床中培養7 d后，用濾紙吸去水分，稱量擬南芥幼苗鮮重，并測量其根長。每處理各設3個重復，以同樣比例的甲醇作對照（0 mg/mL濃度組），甲醇的用量不超過總體積的1%，恒溫搖床的培養溫度22 ℃，轉速105 r/min.，光照周期（L∶D）為16 h∶8 h。

1.2.3 23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗生長影響的測定 分別稱取23-乙酰澤瀉醇B標準品2.00 mg和瀉醇A醋酸酯標準品2.02 mg，加入100 μL甲醇溶解，分別配制成濃度為20 mg/mL的母液，經無菌濾膜過濾，用去離子水配成4個濃度梯度（試驗組終濃度為0.025、0.050、0.100、0.200 mg/mL）的處理溶液。其他試驗方法同1.2.2。

1.3 試驗數據統計分析

測量數據采用Excel 2003進行數據處理，SPSS 16.0統計軟件進行顯著性分析。

相對鮮重=處理組幼苗鮮重/對照組幼苗根長×100%

相對根長=處理組幼苗根長/對照組幼苗根長×100%

2 結果與分析

2.1 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗鮮重的影響

用不同濃度的澤瀉醇提物處理7日齡擬南芥幼苗，對擬南芥幼苗鮮重抑制作用及其顯著性分析結果見圖1。由圖1可見，與澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有較強的抑制作用，呈現較好的量效關系。與對照相比，0.05、0.10、0.20 mg/mL澤瀉醇提物處理組對擬南芥幼苗生長的抑制作用達顯著水平（P<0.05），經0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理組差異達極顯著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理后擬南芥幼苗鮮重僅為對照的45.03%。

2.2 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗根長的影響

澤瀉醇提物在不同濃度條件下，對擬南芥幼苗根長的影響測定結果如圖2所示。由圖2可見，澤瀉醇提物對擬南芥幼苗根長有較強的抑制作用，呈現良好的量效關系。與對照組相比，0.10、0.20 mg/mL處理組對擬南芥幼苗根長的抑制達顯著水平（P<0.05）， 0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理組差異達極顯著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理后擬南芥幼苗根長僅為對照的38.06%。

2.3 萜類化合物23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重的影響

在不同濃度條件下，23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重的影響測定結果如圖3所示。由圖3可見，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗鮮重有較強的抑制作用，呈現良好的量效關系，0.100 mg/mL 23-乙酰澤瀉醇B處理后擬南芥幼苗鮮重僅為對照的51.17%。同等濃度下，澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重無明顯影響。

2.4 萜類化合物23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗根長的影響

23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗根長的影響測定結果如圖4至圖6所示，由圖4、圖5可見，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗根長在0.050 mg/mL濃度時開始表現出抑制效果，隨著濃度的增大其抑制作用越來越強，0.200 mg/mL濃度處理后擬南芥幼苗根長僅為對照的37.10%。澤瀉醇A醋酸酯在0.200 mg/mL濃度時對擬南芥幼苗根長表現出一定的抑制作用（圖4、圖6），但與對照相比無顯著差異。

3 小結與討論

澤瀉次生代謝物的主要成分為萜類物質[9]。萜類是天然物質中種類最多的一類，也是一類重要的化感物質[10]。萜類化感物質合成后大多通過植物體揮發或根系分泌等途徑進入土壤，從而影響自身及鄰近植物的生長[11-17]。通過對兩種澤瀉萜類活性物質23-乙酰澤瀉醇B及澤瀉醇A醋酸酯進行研究，結果表明，23-乙酰澤瀉醇B能夠顯著抑制擬南芥幼苗的生長，而澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗生長沒有明顯抑制作用，這可能與兩種萜類活性物質的化學結構及所含活性基團不同有關[17]。23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗生長的影響表現出較特殊的作用效果，當濃度為0.200 mg/mL時，其對擬南芥幼苗的鮮重和根長的抑制作用較濃度為0.100 mg/mL時有所減弱，而澤瀉醇提物也表現出相似的作用效果。結果表明，23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉醇提物的重要有效成分，可作為新型植物源農藥開發的活性先導物質，同時也可作為潛在的化感物質，對澤瀉生長的周圍環境中其他植物的生長發育產生抑制作用。

近年來，水環境的污染治理成為備受社會關注的問題之一。目前，通過水生植物治理水體污染從而凈化水質是研究的熱點領域。水生植物在水體中重要的生態功能使其在水環境治理中具有很大的應用價值[18]。水生植物通過其植物毒活性物質及化感作用對水環境中的污染源如水華藻類等產生抑制作用，從而達到治理水體污染的目的[19]。本研究選取淺水水生植物澤瀉為供體，用澤瀉醇提物對擬南芥幼苗進行生長抑制試驗。研究結果表明澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的鮮重和根長都有明顯的抑制作用。在濃度為0.40 mg/mL時，擬南芥幼苗鮮重僅為對照的45.03%，根長僅為對照的38.06%，可見澤瀉具有良好的化感作用潛力。同時，通過對澤瀉中兩種重要萜類化合物活性作用的研究發現，23-乙酰澤瀉醇B能夠顯著抑制擬南芥幼苗生長，在濃度為0.100 mg/mL時，擬南芥幼苗鮮重僅為對照的51.17%，根長僅為對照的37.10%，可見23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉的重要有效活性成分，可作為潛在的化感物質發揮作用。因此，進一步深入地開展澤瀉化感作用的研究，在由水體富營養化等因素造成的藻類污染治理方面具有重要意義[20]。

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