希金斯炭疽菌14—3—3蛋白質生物信息學分析

摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病，不僅降低蔬菜的產量，還影響蔬菜的品質。基于釀酒酵母中2個典型14-3-3蛋白質序列，利用Blastp以及關鍵詞對炭疽菌屬蛋白質數據庫進行搜索，明確該菌存在2個典型的14-3-3蛋白質，分別命名為ChFTT1、ChFTT2；對這兩個蛋白質進行理化性質、二級結構、疏水性、信號肽、跨膜結構域以及亞細胞定位等生物信息學分析，可為深入研究希金斯炭疽菌14-3-3蛋白質功能提供參考。

關鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；14-3-3蛋白質；信號肽；二級結構；亞細胞定位

中圖分類號：S435.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3669-04

Bioinformatics Analysis of 14-3-3 Protein in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and

Control of Yunnan Province， Kunming 650224， China）

Abstract： Colletotrichum higginsianum Sacc. can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， reduce the production of vegetables and affect the quality of vegetables. Based on two typical 14-3-3 protein sequences in Saccharomyces cerevisiae， 14-3-3 related protein sequence was searched from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp. Two typical ones named as ChFTT1 and ChFTT2 were identified in C. higginsianum Sacc. Bioinformatics analysis of 14-3-3 proteins including physicochemical properties， the secondary structure， hydrophobic， the signal peptide， trans-membrane domain structure and sub-cellular localization were made. This study will play theoretical foundation for studying the function of 14-3-3 protein in C. higginsianum Sacc.

Key words： Colletotrichum higginsianum Sacc.； 14-3-3 protein； signal peptide； secondary structure； sub-cellular localization

收稿日期：2013-11-20

基金項目：云南省森林災害預警與控制重點實驗室開放基金項目（ZK11A101；ZK11SB01）；云南省教育廳科學研究基金項目（2014Y330）

作者簡介：韓長志（1981-），男，河北石家莊人，講師，博士，主要從事經濟林木病害生物防治與真菌分子生物學研究，（電話）15877923075（電子信箱）

hanchangzhi@gmail.com。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜、小油菜、大白菜以及羽衣甘藍等多種十字花科蔬菜，引起炭疽病，是一類重要的世界性植物病害[1-3]。在我國，菜心炭疽病是菜心上最常見和發生最嚴重的病害之一，該菌也成為限制菜心產量和質量的重要因子[4]。14-3-3蛋白質是由Moore等[5]于1967年首次從牛腦組織中分離得到的一種酸性可溶性蛋白質，其作為結合蛋白質廣泛存在于擬南芥、水稻、番茄等真核生物中[6]。在植物中，該蛋白質可參與赤霉素、脫落酸、油菜素類固醇化合物以及乙烯等植物激素信號通路轉導、MAPK、營養代謝調控和光信號應答等過程[7，8]。此外，該蛋白質還參與植物對滲透脅迫[9]、病原脅迫[10]等多種脅迫的應答。

目前，學術界對希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白質的研究尚未見報道。因此，本研究基于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在的2個典型14-3-3蛋白質（Bmh1、Bmh2）序列[11]，通過對炭疽菌屬蛋白質數據庫Blastp比對及關鍵詞搜索，以期明確希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白質的分布情況，同時，通過生物信息學分析，研究14-3-3蛋白質的基本理化性質、疏水性以及亞細胞定位情況、二級結構特征等，為進一步深入開展該蛋白的功能研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

根據釀酒酵母S288c中Bmh1、Bmh2氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質數據庫（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html）進行在線Blastp比對[12]，E-value選擇1e-50，其他參數均選擇默認值，獲得希金斯炭疽菌中所含有的候選14-3-3蛋白質，同時，通過輸入“14-3-3”，在上述數據庫中進行檢索；另外，利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）明確該菌中14-3-3蛋白質登錄號的信息。endprint

1.2 方法[13]

1.2.1 保守結構域預測 利用SMART網站在線分析希金斯炭疽菌中14-3-3所具有的保守結構域特征。

1.2.2 蛋白質理化性質預測 利用蛋白質數據庫（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線進行分析，預測14-3-3的等電點、分子質量及氨基酸組成等理化性質。

1.2.3 蛋白質二級結構 采用PHD（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在線分析蛋白質的二級結構。

1.2.4 蛋白質疏水性預測 利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）在線分析蛋白質的疏水性。

1.2.5 蛋白質轉運肽及信號肽預測 利用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線分析預測蛋白質轉運肽。同時，利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）在線分析預測蛋白質信號肽，該網站提供兩種計算蛋白質信號肽的算法，一種是隱馬可夫模型（Hidden markov models， HMM），另一種是神經網絡方法（Neural Networks， NN）。對上述兩種方法所預測的蛋白質信號肽結果進行分析。

1.2.6 跨膜區結構預測 利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線分析預測跨膜區結構。

1.2.7 亞細胞定位分析 利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在線進行亞細胞定位分析。

2 結果與分析

2.1 希金斯炭疽菌含有2個典型的14-3-3蛋白質

在炭疽菌屬蛋白質數據庫中，利用Blastp比對分析以及關鍵詞搜索，發現希金斯炭疽菌中存在2個候選的14-3-3蛋白質，其ID為CH063_00205.1、CH063_11444.1（表1）。經過SMART分析結果（圖1）表明，這兩個序列均含有保守的14-3-3結構域，因此，根據其氨基酸大小以及英文縮寫（14-3-3， Fourteen-Three-Three），將其分別命名為ChFTT2和ChFTT1。

2.2 蛋白質理化性質分析

希金斯炭疽菌中2個14-3-3的氨基酸數量差別不大，其相對分子質量、分子式以及原子數量也相差不多（表2）。ChFTT1、ChFTT2的理論等電點分別為4.81、4.77，均屬于酸性氨基酸，上述蛋白質的半衰期較為一致，均為30 h。盡管2個14-3-3蛋白質的不穩定性系數有一定的差別，但其均大于40，屬于不穩定蛋白質。另外，上述兩個14-3-3蛋白質的親水性均為負值。表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均屬于親水性蛋白質。

2.3 蛋白質疏水性分析

利用Protscale程序進行分析，結果表明，希金斯炭疽菌中存在的2個14-3-3蛋白質疏水性情況不同，ChFTT1中位于257位的甘氨酸（E），其親水性最強，為-2.432，而位于175位的亮氨酸（S），其親水性最弱（疏水性最強，下同），為0.853；ChFTT2中位于121位的蛋氨酸（H），其親水性最強，為 -1.626，而位于177位的丙氨酸（S），其親水性最弱，為0.989（圖2）；ChFTT1、ChFTT2親水性氨基酸殘基數值總和分別為-160.308、-137.117，其疏水性氨基酸殘基總和分別為10.984、17.489。希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質的疏水性有所差異，但均為親水性蛋白質，這與通過理化性質分析得到的總平均親水性GRAVY（Grand average of hydropathicity）結果一致。

2.4 轉運肽及信號肽特征

通過分析（表3）表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均可以定位在細胞質中，其中，ChFTT1在分泌途徑信號肽的預測值為0.924，其概率大于0.8，在葉綠體轉運肽、線粒體目標肽的預測值分別為0.059、0.090；ChFTT2在分泌途徑信號肽的預測值為0.907，其概率大于0.8，在葉綠體轉運肽、線粒體目標肽的預測值分別為0.072、0.107。

經過SingnalP 3.0分析，ChFTT1、ChFTT2經NN和HMM預測均不具有信號肽序列。

2.5 二級結構預測

將希金斯炭疽菌的2個14-3-3蛋白質氨基酸序列分別輸入PHD蛋白質二級結構預測網站獲得其二級結構信息，結果表明，2個14-3-3蛋白質均含有α螺旋結構和無規卷曲，均不含有β轉角，其中α螺旋結構所占比例較高（圖3、圖4）。

2.6 跨膜區結構分析

經過TMHMM在線分析，并未發現希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質含有典型的跨膜區結構，這與通過SMART在線分析所獲得的結果一致。

2.7 亞細胞定位分析

目前，研究者對植物中14-3-3蛋白質的細胞定位研究發現，不同物種的蛋白質定位不同，主要集中在細胞核[14]、細胞質[15]、膜或其他細胞腔隙中[16]等。通過TMHMM在線分析發現，希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質的亞細胞定位情況相同，均定位于細胞質中（表4），在細胞核、胞外、線粒體、內質網以及高爾基體中均無定位，這與對禾谷炭疽菌14-3-3蛋白質亞細胞定位情況一致（待發表）。endprint

3 結論與討論

目前，希金斯炭疽菌全基因組序列已經公布，對深入解析其致病相關因子，針對上述致病因子為作用靶標的防治藥劑開發具有重要意義。目前，對植物中的14-3-3蛋白質的功能研究較多，而關于真菌中該蛋白質的研究較為少見。因此，本研究通過利用釀酒酵母中已經報道的2個14-3-3蛋白質的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌屬蛋白質數據庫中進行Blastp比對，以及通過搜索關鍵詞等方法，獲得希金斯炭疽菌中2個典型的14-3-3蛋白質氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息學分析網站對其理化性質、信號肽情況以及跨膜區等進行分析，初步明確了該蛋白質所具有的理化特性、亞細胞定位情況，為今后開展該菌蛋白質的功能研究提供了理論參考。

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3 結論與討論

目前，希金斯炭疽菌全基因組序列已經公布，對深入解析其致病相關因子，針對上述致病因子為作用靶標的防治藥劑開發具有重要意義。目前，對植物中的14-3-3蛋白質的功能研究較多，而關于真菌中該蛋白質的研究較為少見。因此，本研究通過利用釀酒酵母中已經報道的2個14-3-3蛋白質的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌屬蛋白質數據庫中進行Blastp比對，以及通過搜索關鍵詞等方法，獲得希金斯炭疽菌中2個典型的14-3-3蛋白質氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息學分析網站對其理化性質、信號肽情況以及跨膜區等進行分析，初步明確了該蛋白質所具有的理化特性、亞細胞定位情況，為今后開展該菌蛋白質的功能研究提供了理論參考。

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