白木香愈傷組織的誘導及培養

董閃+李明+唐堃+趙盼+趙冬+潘雪峰

摘要：以白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]無菌苗為試驗材料，研究不同激素對其愈傷組織誘導以及生長的影響。結果表明，適合白木香無菌苗誘導愈傷組織的外植體為莖段，適合誘導愈傷組織的6-BA濃度為1.0 mg/L。白木香愈傷組織在MS+0.1 mg/L 6-BA培養基中叢生芽的誘導效果最好；在MS+1.0 mg/L 6-BA的培養基中繼代培養后愈傷組織的增殖量最多；在MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA培養基中繼代培養后愈傷組織的細胞活力最大。

關鍵詞：白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]；愈傷組織誘導；組織培養；細胞活力

中圖分類號：R282；Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3673-05

Callus Induction and Tissue Culture of Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg

DONG Shan，LI Ming，TANG Kun，ZHAO Pan，ZHAO Dong，PAN Xue-feng

（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006， China）

Abstract： Using the aseptic seedling of Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg as materials， the effects of different hormones on induction and tissue culture of callus were studied. The results showed that the explant of aseptic seedling of Aquiliaria sinensis（Lour.） Gilg suitable to induce callus was stem. The appropriate concentration of 6-BA was 1.0 mg/L. Cespitose buds was best induced from callus of Aquiliaria sinensis（Lour.） Gilg in the medium MS+0.1 mg/L 6-BA. The proliferation reached its maximum after subcultured in the medium MS+1.0 mg/L 6-BA. The cell viability reached its maximum after subcultured in the medium MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA.

Key words： Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg；callus induction；tissue culture；cell viability

收稿日期：2014-03-25

基金項目：廣東省科技計劃項目（2011B031700067）；中山市科技計劃項目（20101H022）；廣東藥學院中藥學重點學科專項基金資助

作者簡介：董 閃（1989-），男，湖北廣水人，在讀碩士研究生，研究方向為中藥資源與質量，（電話）13450281721（電子信箱）dongshan0220@126.com；

通訊作者：李 明（1963-），女，黑龍江五常人，主要從事藥用植物資源生態及質量控制研究，（電話）13539843803（電子信箱）

13539843803@163.com。

白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]又名土沉香，其含黑棕色樹脂的心材可加工成國產沉香，具有重要的藥用價值以及商業價值[1]。因白木香的自然繁殖率低，同時受到過量開采，其野生資源銳減，現已列入國家三級瀕危植物[2]。近年來，有些學者對白木香的資源保護以及人工結香進行了研究，并取得了一定成果[3]。本研究在前人研究的基礎上，對白木香不同類型愈傷組織的誘導方法進行分析，比較了不同外植體（莖段、根段、子葉、葉片）和激素（6-BA、NAA、2，4-D）對愈傷組織培養的影響，以期為白木香結香機理和快繁技術的研究提供理想的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試白木香種子采自廣東藥學院大學城校區藥圃，經廣東藥學院李明教授鑒定為瑞香科沉香屬白木香的種子。

1.2 無菌苗的培養

選擇外形飽滿、質地堅硬的新鮮種子，去掉種皮，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒5 min，無菌水洗凈后，接種于含有3%蔗糖和0.6%瓊脂的培養基中，每瓶接3粒種子。培養條件為溫度（26±1） ℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2 愈傷組織的誘導

以萌發40～50 d、生長正常的白木香無菌苗為試驗材料，切取莖段、根段、子葉、葉片作為外植體，分別接入添加了不同濃度6-BA（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）的培養基中，基本培養基為MS，附加3%的蔗糖、0.6%的瓊脂，pH 5.8。每種濃度處理20瓶，每瓶接種相同外植體3株。誘導條件為溫度（25±1） ℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d。接種后每隔7 d觀察記錄一次誘導情況，28 d后統計結果。

1.3 叢生芽的誘導endprint

選取白木香無菌苗的莖段作為叢生芽誘導材料，分別接種于含有不同濃度6-BA（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）的培養基中，基本培養基為MS，附加3%的蔗糖、0.6%的瓊脂，pH 5.8，誘導條件同上。每組接種10瓶，每瓶接種2株，生長28 d后統計出芽情況。

1.4 愈傷組織的繼代培養

以MS+1.0 mg/L 6-BA培養基中由莖段誘導出的愈傷組織作為繼代材料，先接種于不添加任何激素的MS培養基中生長7 d，再取長勢穩定、顏色正常的愈傷組織接種于添加了不同激素的培養基中進行繼代培養，設12組處理（表1）。每組處理10瓶，每瓶接種愈傷組織1株，每株接入的愈傷組織鮮重0.25 g。基本培養基為MS，附加3%的蔗糖、0.6%的瓊脂，pH 5.8。繼代培養條件同上。接種28 d后測定愈傷組織的鮮重和細胞活力。

1.5 白木香愈傷組織活力的測定

一般采用TTC法檢測植物種子和根系的活力，有研究將TTC法用于冷凍細胞活力的檢測[4]。本試驗采用的TTC法參考王躍華等[5]的研究結果，并略加修改，取0.25 g愈傷組織，加0.4% TTC溶液2.5 mL和pH 7的磷酸緩沖液2.5 mL染色4 h，去除染色液，加5 mL甲醇溶解，60 ℃水浴30 min后取溶液檢測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同外植體對白木香愈傷組織誘導的影響

接種28 d后，4種白木香外植體的愈傷組織誘導率如表2所示。由表2可知，白木香莖段的誘導率最高，在添加了1.0、2.0 mg/L 6-BA的培養基中誘導率均達到100%；白木香根段和子葉的愈傷組織誘導率最高分別為53%和57%，培養過程中觀察發現根段出愈時間較晚，子葉容易褐化，二者誘導出的愈傷組織顏色淡綠，生長速度也較為緩慢；葉片在本試驗設置的條件下沒有誘導出愈傷組織。

2.2 不同濃度6-BA對白木香愈傷組織誘導的影響

不同濃度6-BA對3種白木香外植體（莖段、根段、子葉）愈傷組織誘導的影響，結果如圖1至圖3。從圖1可知，對照組（未添加激素）的白木香莖段愈傷組織誘導率較低，添加6-BA后愈傷組織的誘導率明顯提高，且添加的6-BA濃度越高，誘導率也越高；培養21 d，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，誘導率達到100%。

比較不同濃度6-BA對白木香無菌苗根段和子葉愈傷組織誘導率的影響，結果（圖2、圖3）表明，不同濃度6-BA對白木香無菌苗根段和子葉的誘導率要低于對莖段的誘導率，根段和子葉在高濃度（2.0、1.0 mg/L）6-BA作用下的誘導率高于中低濃度（0.5、0.2、0.1 mg/L）6-BA作用下的誘導率。在高濃度6-BA的作用下，大部分愈傷組織均在14 d被誘導出，21 d時趨于平穩，而在低濃度（0.2、0.1 mg/L）6-BA的作用下，根段和子葉的大部分愈傷組織在21 d時才被誘導出，說明高濃度6-BA作用下誘導出白木香愈傷組織的時間較早。

2.3 不同濃度6-BA對白木香叢生芽誘導的影響

白木香莖段接種28 d后，統計長度在1 cm以上的芽的個數，結果如表3所示。由表3可知，通過比較不同濃度6-BA對白木香叢生芽誘導的影響，發現低濃度的6-BA對叢生芽誘導的效果較明顯，0.1 mg/L 6-BA誘導出叢生芽的數量最多，0.2 mg/L 6-BA誘導出叢生芽的出芽率最高；隨著6-BA濃度的升高，白木香叢生芽的出芽數和出芽率逐步減少，說明低濃度（0.2、0.1 mg/L）的6-BA比較適合白木香叢生芽的誘導。

2.4 不同激素對白木香愈傷組織繼代培養的影響

2.4.1 不同激素對白木香愈傷組織增殖的影響 在添加了不同激素的培養基中繼代28 d后，白木香愈傷組織鮮重增加量和增殖倍數如表4所示。從表4可以看出，只添加6-BA時，白木香愈傷組織增殖倍數較高，中濃度（1.0 mg/L）和高濃度（2.0 mg/L）6-BA作用下的增殖倍數分別達到了3.16和3.12，但高濃度6-BA培養下個體增殖差異較大，樣本數據不穩定。只添加KT時，愈傷組織增殖倍數較小，表明KT不適合白木香愈傷組織的增殖培養。

比較不同生長素NAA、2，4-D與6-BA組合對白木香愈傷組織增殖的影響，發現NAA濃度越高，增殖倍數越低，表明低濃度（0.1 mg/L）的NAA與6-BA組合比較適合白木香愈傷組織的增殖；2，4-D濃度越高，增殖倍數越高，表明高濃度（2.0 mg/L）的2，4-D與6-BA組合比較適合白木香愈傷組織的增殖。比較2種生長素發現，NAA與6-BA組合下白木香愈傷組織的增殖倍數比2，4-D與6-BA組合下白木香愈傷組織的增殖倍數要高。

2.4.2 不同激素對白木香愈傷組織生長狀態和細胞活力的影響 在含有不同激素的培養基中繼代28 d后，白木香愈傷組織的形態如圖4所示，用TTC法測定其細胞活力，結果如表5所示。結果表明，在培養基中添加6-BA和中、低濃度（0.1、0.2 mg/L）的NAA后繼代出的愈傷組織狀態較好，顏色為淡綠色、質地疏松、生長穩定，測定出其吸光度值分別達到了1.099和1.089。在只添加6-BA的培養基中繼代后，愈傷組織顏色多為深綠色、質地致密，吸光度值也低于前者。2，4-D與6-BA組合繼代培養中，白木香愈傷組織顏色多為淡黃色、質地疏松，其中高濃度（2.0 mg/L）2，4-D與6-BA組合下培養出的愈傷組織活力較高，吸光度值達1.011。只添加KT時，培養出的愈傷組織顏色為淡綠色，生長緩慢，出現褐化，其細胞活力也較低。

3 小結與討論

在植物愈傷組織的誘導中，不同外植體對愈傷組織誘導的影響較大[6]，本研究以白木香無菌苗為試驗材料，結果表明最適合白木香誘導愈傷組織的外植體為莖段，其次為根段和子葉，葉片不適合愈傷組織誘導。其中，莖段在含有1.0 mg/L和2.0 mg/L 6-BA的MS培養基中愈傷組織誘導率均達到了100%，這主要是因為采用無菌苗作為試驗材料避免了消毒對外植體的損害，提高了愈傷組織誘導的成功率[7]。本研究首次采用白木香無菌苗的根段誘導愈傷組織，并發現其在MS+1.0 mg/L 6-BA的培養基中誘導率達到53%，表明白木香無菌苗根段具有誘導愈傷組織的能力。在不同濃度6-BA的作用下，子葉愈傷組織的誘導率普遍較低，最高只達到了57%，這可能與無菌苗的苗齡過長有關[8]，大部分子葉在接種時都已經失活。葉片則無法誘導出愈傷組織，這可能與誘導環境中光照過強有關，如杜勤等[9]在初步研究白木香愈傷組織的誘導中發現暗培養更適合白木香葉片的愈傷組織誘導。endprint

細胞分裂素在組織培養中常用于誘導細胞分裂和莖的分化增殖，6-BA是第一個人工合成的細胞分裂素，具有防止細胞老化、促進細胞分裂、非分化組織分化、生物體內物質積累、側芽發生等特點[10]，在白木香組織培養中也常將6-BA作為誘導愈傷組織的主要激素[3，9，11]。本研究分析了不同濃度6-BA對白木香愈傷組織誘導的影響，結果表明高濃度（1.0、2.0 mg/L）6-BA作用下愈傷組織的誘導率較高，被誘導出的時間較早；低濃度（0.1、0.2 mg/L）6-BA作用下愈傷組織的誘導率較低，被誘導出的時間較晚，但叢生芽的誘導率較高，這點與葉勤法等[12]在研究白木香組織快繁技術中得到的結論一致。

愈傷組織在不同植物激素的作用下會形成不同形態的愈傷組織[13]，KT與6-BA均為細胞分裂素，二者化學結構和生理功能也較為相似，本研究對比2種分裂素對白木香愈傷組織繼代培養的影響，結果表明KT作用下愈傷組織的增殖倍數和細胞活性顯著低于6-BA作用下愈傷組織的增殖倍數和細胞活性，表明KT不適合白木香愈傷組織的繼代培養。細胞分裂素與生長素的比例高低對愈傷組織的誘導和分化會起到不同的作用[6]，將6-BA與NAA和2，4-D分別組合后，新生的愈傷組織質地較松軟，顏色也較淺，與只添加6-BA相比，其細胞活性略有提高，但愈傷組織的增殖倍數顯著降低。進一步觀察發現，6-BA與NAA組合培養出的愈傷組織顏色多為淺綠色；6-BA與2，4-D組合培養出的愈傷組織顏色多為淡黃色，其生長速度和細胞活性都略低于前者，關于這2種愈傷組織的細胞分化能力、叢生芽誘導能力等方面的差別尚在研究中。

參考文獻：

[1] 中國科學院植物研究所中國高等植物圖鑒（第二冊）[M].北京：科學出版社，1972.

[2] 中國科學院植物研究所中國植物紅皮書——稀有瀕危植物[M].北京：科學出版社，1992.

[3] 徐強興， 吳妃華， 周立賴. 土沉香的組培快繁技術研究[J]. 廣東農業科學， 2006（8）：44-46.

[4] MIKULA A， NIEDZIELSKI M， RYBCZYSKI J J. The use of TTC reduction assay for assessment of Gentiana spp. cell suspension viability after cryopreservation[J]. Acta Physiol Plant， 2006，28（4）：315-324.

[5] 王躍華， 劉益麗， 馬良良，等. TTC—脫氫酶還原法測定滇重樓細胞活力優化條件篩選[J]. 成都大學學報（自然科學版）， 2011，30（1）：1-3.

[6] 唐克軒.中草藥生物技術[M]. 上海：復旦大學出版社，2005.

[7] 汪騰越， 周再知， 裘珍飛，等. 土沉香組織培養外植體消毒方法的研究[J]. 中南林業科技大學學報，2012， 32（3）：44-48.

[8] 秦華偉， 徐躍進， 何 丹，等. 不同因素對黃瓜子葉再生植株影響的研究[J]. 湖北農業科學，2009， 48（7）：1548-1550.

[9] 杜 勤， 王振華， 劉書芬，等. 白木香組織培養的初步研究[J]. 中國中藥雜志，2001（26）：679-680.

[10] MONCALEAN P， RODRIGUEZ A， FERNANDEZ B. In vitro response of Actinidia deliciosa explants to different BA incubation periods[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2001，67（3）：257-266.

[11] 汪騰越. 土沉香組織培養再生體系的研究[D]. 北京：中國林業科學研究院，2012.

[12] 葉勤法， 戚樹源， 林立東. 白木香組織培養及快速繁殖[J]. 植物學通報，1997（14）：60-63.

[13] 吳雙秀. 高山紅景天顆粒狀愈傷組織懸浮培養和紅景天苷的誘導[D].哈爾濱：東北林業大學，2001.endprint