豐肉結海綿相關真菌產黃青霉HLS111菌株活性代謝產物研究

鞏婷，孫傳英，甄心，邱君志，楊金玲，朱平

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豐肉結海綿相關真菌產黃青霉HLS111菌株活性代謝產物研究

鞏婷，孫傳英，甄心，邱君志，楊金玲，朱平

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/國家衛生和計劃生育委員會天然藥物生物合成重點實驗室（鞏婷、甄心、楊金玲、朱平）；350002 福州，福建農林大學生命科學學院（孫傳英、邱君志）

對我國南海水域豐肉結海綿相關真菌產黃青霉菌HLS111 的活性代謝產物進行研究。

采用 HPLC-DAD 技術與活性篩選相結合的方法，通過硅膠柱、凝膠柱及 HPLC 等色譜方法對HLS111 發酵產物進行分離純化；通過核磁共振、質譜等波譜分析手段對分離得到的化合物進行結構鑒定；并對單體化合物進行抗腫瘤、抗 HIV、抗炎活性測定。

分離得到 12 個化合物。其中 2 個黑麥酮酸類化合物：黑麥酮酸F（1）和D（2）；4 個生物堿類化合物：環（L-色氨酸-L-苯丙氨酸）（3）、citreoindole（4）、meleagrin（5）、腦苷脂B（6）；4 個甾體類化合物：麥角甾醇（7）、(22E,24R)-5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-烯-3β-醇（8）、globosterol（9）、β-谷甾醇（10）；1 個三萜類化合物：24-亞甲基環木菠蘿烷醇-反式阿魏酸（11）；1 個蒽醌類化合物：大黃素（12）。對化合物 4 的氫譜、碳譜數據進行了歸屬。初步的藥理研究表明，黑麥酮酸類化合物表現出較強的抗腫瘤活性，化合物 citreoindole 表現出一定的抗 HIV 及抗炎活性。

海綿相關真菌產黃青霉 HLS111 菌株體現了次生代謝產物化學結構的多樣性；黑麥酮酸類化合物為產黃青霉HLS111 的主要抗腫瘤活性成分。

青霉，產黃； 抗生素類，抗腫瘤； 抗 HIV 藥； 海綿相關真菌

“活化石”海綿作為一種最古老的后生動物，近些年來在天然產物研究領域變得炙手可熱。由于特殊的管腔結構和獨特的濾食性生活方式使其成為了名副其實的“微生物資源庫”，其相關微生物可占到海綿總重的 40% ~ 60%，比海水中含量高出約兩個數量級[1]。因而在進行海洋微生物次生代謝產物的分離純化研究時，以海綿作為載體來分離得到微生物具有很明顯的優勢，同時還有一些研究認為海綿相關微生物才是海綿活性物質的真正生產者[2]。

本課題組前期對從我國南海水域采集的豐肉結海綿（）相關真菌的生物多樣性[3]及化學多樣性[4-6]進行了相關研究。本論文的研究對象為豐肉結海綿中一株真菌HLS111（GenBank accession No. FJ770066），通過16s rRNA 分子生物學方法初步判定該菌株為產黃青霉（）[3]。活性篩選發現該菌株的發酵產物顯示了較強的抗腫瘤活性。通過對該菌株的大米固體發酵物進行提取分離，目前已從該菌株的發酵產物中分離得到了 12 個化合物，其中黑麥酮酸類化合物被初步認定為該菌株的主要抗腫瘤活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產黃青霉菌株HLS111 為本實驗室保存。

1.1.2 培養基

⑴斜面培養基（YPD培養基）：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、葡萄糖 20 g/L、天然海水，調 pH 6.0，加 1.5% 瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

⑵種子培養基（YM 培養基）：麥芽提取物10 g/L、葡萄糖 4 g/L、酵母提取物 4 g/L、天然海水，調 pH 6.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，冷卻后備用。

⑶發酵培養基（大米固體培養基）：500 ml 三角瓶中加入 100 g 大米和 100 ml 天然海水，浸泡3 ~ 5 h，121 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min，冷卻后備用。

1.1.3 儀器 Mercury-300、Mercury-400、VNS-600 核磁共振儀為美國 Varian 公司產品，Avance-500 核磁共振儀為瑞士 Bruker 公司產品，均以 TMS 作為內標；1100 LC/MSD Trap SL 型液相質譜聯用儀和1200 分析型高效液相為美國 Agilent 公司產品；VGZAB-2F 型質譜儀為英國 Micromass 公司產品；LC-6AD 型半制備液相為日本島津公司產品；HZQ-Q 恒溫振蕩搖床由哈爾濱東聯科學儀器有限公司生產。

1.1.4 色譜填料 色譜柱分別為 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）和 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（9.4 mm ×250 mm，5 μm）；Sephadex LH-20 購自美國 GE Healthcare 公司；薄層色譜用層析板購自煙臺化工研究所；柱色譜用硅膠（200 ~ 300 目、60 ~ 100 目）購自青島海洋化工廠。

1.1.5 試劑 常用分析純試劑購自北京化學試劑廠；色譜純甲醇購自北京宏達欣宇科技有限公司；胰蛋白胨購自英國 Oxoid 公司；葡萄糖和瓊脂購自北京拜爾迪生物科技有限公司；酵母提取物購自北京雙旋微生物培養基制品廠；大米購自黑龍江青清源公司；海水采自河北秦皇島海域。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發酵培養 將 HLS111 菌株轉接至新鮮 YPD斜面，于 28 ℃培養 7 d 后，接種于液體 YM 培養基中，28 ℃、180 r/min 培養 5 d，將培養好的種子培養基按 1:10（ml/g）比例轉接于大米固體培養基中，室溫下（約 25 ℃）靜置培養40 d。

1.2.2 發酵產物的提取與分離 將培養好的 HLS111 發酵物4000 g用 95% 乙醇超聲提取，每次超聲 30 min，共提取 3 次，得到粗浸膏 150.0 g。粗浸膏分散于蒸餾水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮干燥得到石油醚組分 30.0 g、乙酸乙酯組分 24.0 g、正丁醇組分 38.0 g、水組分 50.0 g。

取石油醚組分 5.0 g，采用硅膠柱（200 ~ 300 目）色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，各流分經 TLC 檢測合并成 8 個部分（Fr. P1 ~ P8）。Fr. P1 再經硅膠柱（200 ~ 300 目）色譜，二氯甲烷-丙酮（30:1 → 15:1）梯度洗脫，分成 3 個部分（Fr. P1.1 ~ P1.3），Fr. P1.2 經 Sephadex LH-20 凝膠柱，RP-HPLC半制備得到化合物 7（15.0 mg）和 10（5.2 mg）。Fr. P6 部分經甲醇重結晶得化合物 6（20.0 mg）。

乙酸乙酯組分24.0 g，采用硅膠柱（200 ~300目）色譜，二氯甲烷-丙酮（25:1 → 2:1）梯度洗脫，各流分經 TLC 檢測合并成 9 個部分（Fr. E1 ~ E9）。Fr. E2 經甲醇重結晶得化合物 11（20.0 mg）。Fr. E3 同樣經甲醇重結晶兩次得化合物 8（25.2 mg），母液經 Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化，再經 RP-HPLC 半制備得化合物 12（3.4 mg）。Fr. E5 經硅膠柱（200 ~ 300目）色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，其中 Fr. E5.23（石油醚:二氯甲烷:甲醇 = 2:3:0.03）用石油醚和環己烷重結晶得化合物 1（1.0 g）；Fr. E5.30（石油醚:二氯甲烷:甲醇 = 2:3:0.05）用 Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化，再用石油醚和環己烷重結晶得化合物 2（200.0 mg）。Fr. E7 與 Fr. E8 用甲醇重結晶分別得到化合物 3（10.0 mg）和 4（500.0 mg）。Fr. E9 部分經硅膠柱（200 ~ 300 目）色譜，二氯甲烷:甲醇（15:1 ~ 1:1）梯度洗脫，Fr. E9.7（二氯甲烷:甲醇 = 10:1）用 Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化得化合物 5（9.0 mg）；Fr. E 9.11（二氯甲烷:甲醇 = 8:1）用甲醇重結晶得化合物 9（20.0 mg）。

1.2.3 體外抗腫瘤活性測定 具體實驗方法參照文獻[7]。

1.2.4 抗 HIV 活性測定 將 293 細胞按 2.2′106個/皿接種到 100 mm 培養皿中，24 h 后，用改良的磷酸鈣共轉染 3 μg VSV-G 質粒和8 μg pNL4-3.luc.R-E-（HIV-1 核心），16 h 后，用 PBS 沖洗細胞并換新鮮的培養基繼續培養 32 h，收集上清液并經 0.45 μm 的濾膜過濾，過濾后的上清液中含有 VSV-G/HIV 偽病毒顆粒。感染前一天，按 6′104個/孔接種到 24 孔板上。用 DMSO 溶解陽性對照化合物或待篩選化合物，感染前 15 min 加入細胞培養液中，以 DMSO 溶劑作空白對照。用適宜稀釋度的病毒液感染細胞，感染 48 h 后，VSV-G/HIV-luc 感染的細胞每孔加入 50 μl 細胞裂解液，將 30 μl 熒光素酶底物與 20 μl 細胞裂解液混合后用熒光檢測器測定細胞熒光素的活性，其活性的強弱反映 HIV-1 復制的水平。抑制率采用下列公式計算：

抑制率（%）=（對照組平均熒光素酶活性單位– 樣品組平均熒光素酶活性單位）/對照組平均熒光素酶活性單位× 100%

1.2.5 抗炎活性的測定 實驗方法參照文獻[5]。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物 1 ~ 12 的質譜（正離子、負離子 ESI-MS，EI-MS）、核磁共振譜（1H-NMR、13C-NMR）數據與相關文獻報道數據一致，故確定其為黑麥酮酸 F（1）[8]、黑麥酮酸 D（2）[8]、環（L-色氨酸- L-苯丙氨酸）（3）[9]、citreoindole（4）[10]、meleagrin（5）[11]、腦苷脂 B（6）[12]、麥角甾醇（7）[5]、(22E,24R)-5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-烯-3β-醇（8）[13-14]、globosterol（9）[15]、β-谷甾醇（10）[6]、24-亞甲基環木菠蘿烷醇-反式阿魏酸（11）[16]、大黃素（12）[17]，結構見圖 1。通過 HMBC、HSQC、1H-1H COSY 譜對化合物 4 的氫譜、碳譜數據進行了歸屬。

化合物 4 為白色粉末（甲醇），正離子 ESI-MS: 497.3 [M+H]+、519.2 [M+Na]+，分子式為C29H28O4N4。1H-NMR（DMSO-6，500 MHz）:10.31（1H，s，2-CHN），9.11（1H，s，2'-CHN），7.99（1H，d，J = 8.0 Hz，H-8），7.42（2H，d，J = 8.0 Hz，H-5''，H-9''），7.40（1H，m，H-7'），7.39 （2H，dd，J = 8.0，8.0 Hz，H-6'，H-8'），7.32（2H，m，H-6''，H-8''），7.30（1H，dd，J = 8.0，8.0 Hz，H-9），7.25（1H，dd，J = 8.0，8.0 Hz，H-7''），7.16（1H，dd，J = 8.0，8.0 Hz，H-10），7.13（2H，m，H-5'，H-9'），6.99（1H，d，J = 8.0 Hz，H-11），6.52（1H，s，J = 6.0 Hz，4-OH），4.89（1H，d，J = 9.0 Hz，H-2），4.66（1H，d，J = 13.0 Hz，H-5），4.37（1H，d，J = 4.5 Hz，H-2'），4.32（1H，dd，J = 11.5，5.0 Hz，H-2''），3.17（1H，br d，J = 13.5 Hz，H-3'β），2.88（1H，dd，J = 13.5，4.5 Hz，H-3'α），2.77（1H，d，J = 13.0 Hz，2''-CHN），2.70（1H，dd，J = 17.5，5.0 Hz，H-3''α），2.45（1H，dd，J = 17.5，11.5 Hz，H-3''β），1.53（1H，d，J = 14.5 Hz，H-3β），0.82（1H，dd，J = 14.5，9.0 Hz，H-3α）。13C-NMR（DMSO-6，125 MHz）: 168.9（C-1），166.8（C-1''），160.0（C-1'），142.4（C-4''），139.7（C-7），135.3（C-4'），134.4（C-12），130.8（C-5'，C-9'），129.5（C-9），128.6（C-6''，C-8''），128.4（C-6'，C-8'），127.4（C-7''），127.2（C-7'），126.6（C-5''，C-9''），124.1（C-10），123.6（C-11），116.3（C-8），80.9（C-5），73.7（C-4），57.6（C-2），55.3（C-2'），55.2（C-2''），38.8（C-3'），38.5（C-3''），38.4（C-3）。

Figure 1 Structures of compounds 1 - 12

2.2 體外抗腫瘤活性篩選

采用 MTT 法測定了化合物 1 ~12 對 HCT-8、BEL-7402、BGC823、A549 和 A2780 5 個腫瘤細胞系的抑制活性。結果表明，化合物 1 和 2 對上述 5 種細胞均顯示出明顯的抑制活性（表 1），其他化合物未表現出細胞增殖的抑制作用。

表 1 化合物 1 和 2 對 5 種腫瘤細胞系的體外細胞毒活性

2.3 抗 HIV 活性篩選

通過重組病毒模型測定了化合物 1 ~ 12 對抗HIV 的活性。結果顯示，化合物 4 抗HIV 的 IC50值為 13.58 μmol/L，其余化合物均沒有明顯的抗 HIV 活性。

2.4 抗炎活性篩選

采用 Griess 法對化合物 1 ~ 12 進行了抗炎活性篩選，以 LPS 誘導小鼠腹腔巨噬細胞釋放 NO 作為研究指標。在 10 μmol/L 濃度時化合物4 表現出抑制分泌 NO 的能力，抑制率為 58.1%，而陽性對照藥地塞米松（DEX）的抑制率為 66.1%。

3 討論

從我國南海豐肉結海綿產黃青霉菌HLS111 大米固體發酵產物中分離得到 12 個化合物，包括2 個黑麥酮酸類化合物，4 個生物堿類化合物，4 個甾體類化合物，1 個三萜類化合物，1 個蒽醌類化合物，體現出所選菌株次生代謝產物化學結構的多樣性。同時首次對化合物citreoindole 的氫譜和碳譜數據進行了歸屬。在對分離得到的單體化合物進行抗腫瘤、抗 HIV、抗炎等活性篩選中，發現黑麥酮酸類化合物（1 和 2）表現出較強的抗腫瘤活性，citreoindole 表現出一定的抗 HIV 及抗炎活性。初步推斷黑麥酮酸類化合物為該菌株的主要抗腫瘤活性成分。

黑麥酮酸是一系列麥角色素類物質，存在于一些生存于糧食作物中的真菌代謝產物中。當這些真菌著生于大米、玉米、黑麥作物上時即產生一種或多種黑麥酮酸，它們是一組氧雜蒽酮二聚物的同分異構體[18]。經文獻調研，黑麥酮酸類化合物具有抗菌[19-20]、抗腫瘤[21]、神經保護[22]等活性，研究較多的是黑麥酮酸 D（SAD）及黑麥酮酸 A（SAA）。Ishida[19]研究表明，只有枯草芽孢桿菌和須癬毛癬菌對于 SAD 敏感。Sudhir 等[20]在新菌株 MF 7022 和（或）MF 7023（sp.）中發現4 種具有部分黑麥酮酸結構的化合物，其在植物和哺乳動物體內均顯示良好的抗真菌活性。SAD 對埃利希腹水癌、S-180 肉瘤、NIV-MF 和 D3M-16 乳腺癌有極強的抗癌活性，但其具有相當的毒性[21]。因此人們希望通過結構修飾降低其毒性并取得顯著成果，二-（2'-四氫呋喃）SAD 和二-（2'-四氫吡喃）SAD 不僅抗腫瘤活性提高，且毒性得到降低，還提高了模型動物的免疫力[22]。通過生物轉化或化學修飾等方法繼續對黑麥酮酸類化合物的結構優化，有望使其成為抗腫瘤藥物而應用于臨床。

志謝 化合物波譜數據的測定由本所藥物分析室幫助完成；化合物體外抗腫瘤活性篩選由本所藥理室陳曉光課題組完成；抗 HIV 活性篩選由本所藥理室郭穎課題組完成；抗炎活性篩選由本所藥理室侯琦課題組完成。在此深表感謝！

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Bioactive metabolites isolated from the fungusHLS111 associated with the marine sponge

GONG Ting, SUN Chuan-ying, ZHEN Xin, QIU Jun-zhi, YANG Jin-ling, ZHU Ping

To study the active metabolites produced by the fungusHLS111 isolated from the marine spongecollected from the South China Sea.

Based on the technique of high performance liquid chromatography- diode array detector (HPLC-DAD) and the bioactive screening,chemical isolation and purification of the metabolites from the fermentation broth of the strain were conducted by means of silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography and HPLC, etc. Their structures were elucidated by MS, NMR and other spectroscopic analysis. Their anti-tumor, anti-HIV, anti-inflammatory activitiesalso were detected.

Twelve metabolites were isolated, including two secalonic acids [secalonic acid F (1) and secalonic acid D (2)]; four alkaloids [cyclo (L-Tyr-L-Phe) (3), citreoindole (4), meleagrin (5), cerebroside B (6)]; four steroids [ergosterol (7), (22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol (8), globosterol (9), β-sitosterol (10)]; one triterpenoid [24-methylenecycloartanol trans-ferulate (11)], and one anthraquinone [emodin (12)]. The1H-NMR and13C-NMR spectral data of compound 4 were assigned for the first time. Preliminary pharmacological studies showed that secalonic acids (1 and 2) exhibited strong antitumor activities, citreoindole (4) possessed moderate anti-HIV and anti-inflammatory activities.

The secondary metabolites isolated from marine fungusHLS111 are rich in structural types. Secalonic acids are the main antitumor components of this fungus.

Penicillium chrysogenum; Antibiotics, antineoplastic; Anti-HIV agents; Marine fungus

ZHU Ping, Email: zhuping@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.003

國家“十二五”科技重大專項“綜合性新藥研究開發技術大平臺”（2012ZX09301002-001-005）；中央高校基本科研業務費（2012N06）；天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室自主課題 C 類課題（GTZC201215）

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2013-12-25

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of the National Health and Family Planning Commission, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (GONG Ting, ZHEN Xin, YANG Jin-ling, ZHU Ping); The School of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China (SUN Chuan-ying, QIU Jun-zhi)