人CaMKKβ蛋白的原核表達、純化及活性測定

劉亞晉，譚初兵，時麗麗，潘曉菲，徐為人

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人CaMKKβ蛋白的原核表達、純化及活性測定

劉亞晉，譚初兵，時麗麗，潘曉菲，徐為人

300070 天津醫科大學基礎醫學院（劉亞晉、潘曉菲）；300193 天津藥物研究院天津新藥設計與發現重點實驗室（譚初兵、時麗麗、徐為人）

對原核體系表達的 CaMKKβ 蛋白體外活性進行探索，為針對 CaMKKβ、AMPK 藥物研發提供科研基礎。

克隆人 CaMKKβ 基因，建立原核表達載體 pET28a-CaMKKβ，將其轉化入Rosetta(DE3) 感受態細胞內，在 16 ℃、0.02 mmol/L IPTG 條件下誘導重組表達 CaMKKβ 蛋白，Ni-NTA 純化6His-CaMKKβ 蛋白，并利用 Glo? Max Assay 方法檢測其活性。

通過基因測序表明 pET28a-CaMKKβ 質粒構建成功；重組人 CaMKKβ 蛋白可溶性表達量較高，Ni-NTA 純化 6His-CaMKKβ 蛋白純度可達 80% 以上，活性檢測結果表明，大腸桿菌體系內表達的人 CaMKKβ 蛋白在 CaM/Ca2+存在與否情況下，酶活基本一致。

成功構建原核表達載體 pET28a-CaMKKβ，實現重組人 CaMKKβ 在原核體系內可溶性表達，活性測定表明原核體系內表達的 CaMKKβ 自主酶活性較強，受 CaM/Ca2+影響較小。

鈣-鈣調素依賴性蛋白激酶； 腺苷酸活化蛋白激酶； 色譜法，親和； CaM/Ca2+

鈣調蛋白（calmodulin，CaM）作為一種廣泛存在的第二信使，受 Ca2+濃度的調節，參與細胞內眾多信號通路的調控：cAMP 合成與分解的腺苷酸環化酶和磷酸二酯酶酶活調控、CaMKs/CaM（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，CaMKs）信號級聯的調控等[1-2]。CaMKs 還包括 CaMKI、CaMKII、CaMKIV等[3]，CaMKK（Ca2+/calmodulin- dependent protein kinase kinase，CaMKKs）是 CaMKs 家族中的主要成員，有CaMKKα 和CaMKKβ 兩種亞型，可通過磷酸化激活 CaMKI、CaMKIV、PKB、SAD-B 等[4-6]。CaMKKα 活性僅受 CaM/Ca2+信號的調控，而 CaMKKβ 除受 CaM/Ca2+信號調控外，還具有自主活性，后者可通過磷酸化 Thr/Ser 位點激活下游底物腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）等[7-8]。

CaMKKβ 在體內廣泛分布，尤其在神經系統[9-10]、睪丸、脾臟、肝臟、肺等組織器官內，可參與多種生理活性的調控，如神經系統、腫瘤、能量代謝[11]、外圍髓系粒細胞發育調控[12]等，是功能最廣泛的 CaMKs 之一。CaMKKs 的信號級聯反應對神經元進程中的磷酸化起重要作用，這些進程包括學習和記憶形成[13-14]、神經分化和遷移[9-10]、軸突生長和突觸發生[15-16]等。在中樞神經系統內，CaMKKβ 廣泛分布于海馬區、嗅球、齒狀回、杏仁核、下丘腦、小腦[17]，因此，CaMKKβ 在海馬記憶、小腦發育、下丘腦激素分泌及能量攝入-消耗調控中發揮著重要的作用。研究證明，在下丘腦神經元內 CaMKKβ 與 AMPK、Ca2+/CaM 形成復合物，發揮著調控能量動態平衡的重要作用；基因敲除 CaMKKβ 后，AMPK 活性降低，同時 NPY（neuropeptide Y）和 AgRP（agouti-related protein）基因表達下調，雖然可避免小鼠形成由飲食誘導的肥胖、高血糖和胰島素抵抗等[18-19]，但同正常喂養的野生小鼠相比，CaMKKβ 基因缺失的小鼠含有較多脂肪組織，且生長緩慢。此外，在肝臟、肌肉、脂肪等組織器官內，CaMKKβ 均可通過調整 AMPK 活性在能量平衡中發揮重要功能。在原代肝細胞內，CaMKKβ 可通過改變胞內葡萄糖-脂肪的能源利用模式，提升整個機體的葡萄糖能量平衡[20]。在前脂肪細胞內敲除 CaMKKβ 基因，促進了前脂肪細胞到脂肪細胞的分化[21]。CaMKKβ 在外周組織營養過剩的調節中發揮關鍵作用，因此被認為是治療 2 型糖尿病藥物開發的潛在靶點。另外有研究表明，CaMKKβ 與雄激素受體調控的前列腺腫瘤密切相關，其抑制劑 STO-609 在前列腺腫瘤的抑制方面也表現出較好的作用[22-24]。

本文旨在原核體系內有效表達人 CaMKKβ 蛋白，通過研究 CaMKKβ 功能與活性，為建立 CaMKKβ 及 AMPK 藥物篩選模型及相關藥物研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒TOP10 感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；Rosetta(DE3) 菌株和 pET28a 質粒由本實驗室保存；pOTB7-CaMKKβ 質粒購自廣州復能基因有限公司。

1.1.2 試劑 限制性核酸內切酶I、I，primer STARHSDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶均購自大連寶生物公司；5000 bp DNA 分子量標準購自北京天為時代科技有限公司；PCR 純化試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京原平皓生物技術有限公司；質粒小量抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌培養基蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自美國 Oxoid 公司；瓊脂購自美國 Difco 公司；IPTG 購自德國 Merck 公司；卡那霉素、氯霉素、咪唑、重組人鈣調蛋白購自美國Amresco 公司；Glo? Max Assay 試劑盒購自美國 Promega 公司；ATP、DTT 購自美國 Sigma 公司；AMPK 肽由北京恒宇視野生物科技有限公司合成；其他均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴增人 CaMKKβ 基因 根據 GenBank公布的人 CaMKKβ 基因（No. NM_006549.3）核酸序列，用 Omega 軟件設計引物，CaMKKβ 上游引物：5' GGAATTCCATATGGACTGTGTGCAGCT GAATCA 3'，CaMKKβ 下游引物：5' CCGCTCGAG TCACTTCACCAGGATCACGGTT 3'，以 pOTB7- CaMKKβ 質粒為模板進行基因擴增，PCR 反應程序為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性 10 s，56 ℃退火 30 s，72℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存備用。

1.2.2 構建 pET28a-CaMKKβ 表達載體 以I 和I 雙酶切處理經瓊脂糖凝膠回收的 CaMKKβ PCR 擴增產物，與經I 和I 雙酶切處理的 pET28a 載體片段連接，轉化至感受態TOP10 細胞內，涂布至含有卡那霉素（50 μg/ml）的 LB 固體培養基上，挑取陽性單克隆進行菌落 PCR 及I/I 雙酶切鑒定，經 DNA 測序確證無誤的克隆命名為 pET28a- CaMKKβ。

1.2.3 確定CaMKKβ 蛋白表達誘導條件

⑴IPTG 濃度確定：分別將表達載體 pET28a、pET28a-CaMKKβ 轉化至Rosetta(DE3)感受態細胞內，挑取單克隆至含有 25 μg/ml 卡那霉素和 17 μg/ml 氯霉素的 LB 液體培養基中培養；將活化好的菌體接種于新的 LB（含 25 μg/ml 卡那霉素和 17 μg/ml 氯霉素）培養基中，37 ℃，220 r/min 振搖 3 h；待菌液600至 0.6，加入 IPTG（IPTG 濃度設置為 0、0.02、0.1、0.5、1.0 mmol/L），培養條件為 16 ℃，220 r/min 振搖過夜，進行蛋白表達誘導；離心收集菌體，制備樣品，進行 10% SDS-PAGE 電泳檢測重組蛋白表達情況。

⑵溫度確定：將活化好的含有質粒 pET28a、pET28a-CaMKKβ 的Rosetta(DE3) 菌體接種于含有 25 μg/ml 卡那霉素和 17 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基中，37 ℃，220 r/min 振搖 3 h；待菌液600至 0.6，加入 IPTG 至 0.02 mmol/L，溫度設置為：16、20、25、30、37 ℃，220 r/min 振搖過夜，進行蛋白表達誘導；離心收集菌體，制備樣品，進行 10% SDS-PAGE 電泳檢測重組蛋白表達情況。

1.2.4 Ni-NTA 親和層析純化重組人 CaMKKβ 蛋白 按上述確定好的條件進行 CaMKKβ 蛋白表達誘導，表達條件為：IPTG 終濃度為 0.02 mmol/L，16 ℃，220 r/min 振搖過夜；收集菌體；用緩沖液25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，250 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟重懸菌體，冰上靜置 30 min，于 4 ℃進行高壓勻漿破碎菌體；裂解液中添加 Triton X-100 至終濃度 0.03%，4 ℃、10 000 ×離心 60 min，上清經 0.45 μm 濾膜過濾，使用自動蛋白純化儀 AKTA 進行 Ni-NTA 親和層析；目的蛋白經 20 ~ 250 mmol/L 咪唑線性梯度洗脫，SDS-PAGE 凝膠電泳檢測；蛋白樣本經 4 ℃透析，超濾濃縮并測定濃度，于–80 ℃保存。

1.2.5 BCA 法測定蛋白濃度 根據 BCA 蛋白濃度定量試劑盒使用說明進行操作，測定純化的 CaMKKβ 蛋白濃度。

1.2.6 測定重組人 CaMKKβ 蛋白酶活 將重組人 CaMKKβ 蛋白溶液用新鮮的透析緩沖液分別稀釋至 1、0.5、0.25、0.1、0.05 mg/ml，冰上放置；在白色 384 孔板中待測孔內加入備好的 CaMKKβ 蛋白液10 μl，反應液 10 μl（50 mmol/L HEPES pH 7.5，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，10 mmol/L MgCl2，400 μmol/L ATP，10% 丙三醇，500 μmol/L AMPK 肽，序列為：GEFLRTSCGSP），Ca2+/CaM組另加入 1 mmol/L CaCl2和 0.2 μmol/L 鈣調蛋白，共 20 μl，充分混勻，30 ℃孵育 30 min；加入 ADP-Glo? 激酶檢測試劑 20 μl，30 ℃孵育 30 min；加入 ADP-Glo? Max 檢測試劑 40 μl，酶標儀動態檢測 1 h。

2 結果

2.1 人 CaMKKβ 基因片段的擴增

以 pOTB7-CaMKKβ 質粒為模板，擴增人 CaMKKβ 基因片段，PCR 產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，在 1000 ~ 2000 bp 之間有一特異性明亮條帶，大小與預期值 1767 bp 相符，見圖 1。

bp M 1 500030002000 1000750500

Figure 1 PCR product of human CaMKKβ gene

2.2 表達載體 pET28a-CaMKKβ 的構建

對提取的 pET28a 載體及回收的 CaMKKβ PCR 產物進行I 和I 雙酶切，切膠回收酶切后的載體片段及基因片段，經 T4DNA 連接酶進行連接，轉化入TOP10 感受態細胞內，挑取陽性克隆子進行菌落 PCR 驗證（圖 2），未轉化的TOP10 菌株未見明顯擴增條帶，菌株 2 ~ 6 號均擴增出與預期大小一致的基因條帶；提取質粒進行I/I 雙酶切驗證，結果見圖 3，空載體 pET28a 并未見有目的條帶被切下，而陽性克隆子的質粒 2 ~ 5 號均酶切下與預期大小一致的基因條帶；同時，經 DNA 測序結果可知，插入基因片段及閱讀框完全正確，此載體命名為 pET28a-CaMKKβ。

1 2 3 4 5 6 Mbp 2000 1000 750500 100

Figure 2 Colony PCR validation of pET28a-CaMKKβ vector construction

1 2 3 4 5 Mbp 500030002000 1000 750500

M：蛋白分子量標準；1：pET28a 空載體；2 ~ 5：pET28a-CaMKKβ 轉化TOP10 陽性克隆子

M: DNA marker; 1: Product of pET28a plasmid digested withI/I; 2 - 5: Product of pET28a-CaMKKβ plasmid digested withI/I

注：箭頭指示為雙酶切下的CaMKKβ 基因片段

Note：The arrows indicate gene fragment digested withI/I

圖 3I/I 雙酶切驗證 pET28a-CaMKKβ 載體

Figure 3 pET28a-CaMKKβ digested withI/I

2.3 重組人 CaMKKβ 蛋白表達條件確定

如圖 4 所示，經 16 ℃、220 r/min 過夜培養，CaMKKβ 蛋白在不同濃度 IPTG 誘導后均有表達，IPTG 濃度為 0.02 mmol/L 時蛋白表達量已達到平臺期，且主要為可溶性表達，蛋白大小為 65.5 kD，隨著 IPTG 濃度升高，重組蛋白表達量并未見明顯升高，確定 IPTG最佳誘導濃度均為0.02 mmol/L。CaMKKβ 酶可磷酸化下游底物AMPK，使得AMPK 活性大幅提升（數據未列出），表明此蛋白重組表達成功。

kD M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 170130957255433426 CaMKKβ

Figure 4 Determination of IPTG concentration for inducing recombinant CaMKKβ expression

2.4 重組人 CaMKKβ 蛋白純化

將 pET28a-CaMKKβ 質粒轉化至Rosetta(DE3) 內，表達條件為：16 ℃、220 r/min、0.02 mmol/L IPTG，過夜誘導表達，重組人 CaMKKβ 蛋白大部分以可溶形式存在。經 Ni-NTA 柱親和層析純化，得到純度 80% 以上的目的蛋白（Quantity one 軟件測定），見圖 5。

2.5 重組人 CaMKKβ 蛋白活性測定

通過 BCA 法測定重組人 CaMKKβ 蛋白濃度，將蛋白濃度調整到 1 mg/ml，使用Glo? Max Assay 法測定蛋白活性。結果顯示，在不加 Ca2+/CaM 反應體系里，CaMKKβ 活性為濃度依賴性升高；在含有 Ca2+/CaM 活性體系內，CaMKKβ 活性也是濃度依賴性升高，但加入 Ca2+/CaM 后對 CaMKKβ 活性并無提升作用，與未加入 Ca2+/CaM 組相比，其活性略低（圖 6），但無統計學意義，與文獻[25]中報道的大腸桿菌表達 CaMKKβ 的酶活受 Ca2+/CaM 影響較小的結果一致。

3 討論

CaMKKβ 的 cDNA 片段分析結果顯示，約90% 物種的 CaMKKβ 的編碼氨基酸序列相似度較高，僅僅在 3' 端非編碼區域存在異質性[26]。CaMKKβ 與其他 CaMKs 有著類似結構組成：激酶催化結構域（kinase domain，KD）、C 端自主抑制結構域（auto-inhibitory domain，AID）、包含在 AID 中的鈣調素結合結構域（calmodulin-binding domain，CBD）[7]。其參與級聯反應的過程為：細胞內 CaM 與 Ca2+結合后構象發生改變，可結合靶點蛋白 CaMKs[9]；CaMKs 與 Ca2+/CaM 結合后構象也隨之發生改變，釋放激酶的自主抑制結構域；隨之，CaMKKβ 磷酸化 CaM I（Thr-200）和 CaM IV（Thr-177），可顯著提高后者的活性，調控相應的信號通路。另外，AMPKα 也是 CaMKKβ 的主要作用底物，在 LKB1 缺乏的細胞內，AMPK 的磷酸化及酶活的提升主要依賴 CaMKKβ 完成[27]。

kD M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 17013095 725543 34

Figure 5 Ni-NTA affinity chromatography purification of recombinant CaMKKβ

圖6 Glo? Max Assay 法測定重組人CaMKKβ 活性

Figure 6 Recombinant CaMKKβ activity determination by Glo? Max Assay method

目前，調控 CaMKKβ 酶活性的詳細機制并不清楚，CaMKKα 活性受 CaM/Ca2+嚴格控制，而 CaMKKβ 在缺乏 CaM/Ca2+下表現出一定的自主活性，可占總活性的 60% ~ 70%[25]。通過截短突變（位于 N 端催化區域的 129-151 aa 被切掉）實驗，證明 AID 區是 CaMKKβ 酶活調控的一個最主要的調控因素。同時，通過質譜檢測小鼠、大鼠、人不同種屬間的 CaMKKβ，結果發現 Ser-129、Ser-133、Ser-137 三個磷酸化位點是相當保守存在的，此三位點被 CDK5/GSK3 磷酸化后其自主活性明顯降低。三位點未突變的 CaMKKβ 酶活表現出了明顯的自主活性，但在 CaM/Ca2+依賴的酶活中并沒有明顯不同，顯然，磷酸化 Ser-129、Ser-133、Ser-137 三個位點能提高 CaMKKβ 蛋白穩定性[25]。而針對底物 CaMKI、CaMKII、CaMKIV，CaMKKβ 在 CaM/Ca2+不存在時即可將其磷酸化；對于底物 AMPK，AMPK、CaMKKβ 兩者必須均在活化狀態下才能將前者磷酸化，此有助于解釋相同的變構激活劑負責兩種酶級聯反應的難題。同時，從哺乳動物細胞內純化的 CaMKKβ 蛋白組成型磷酸化，所以其活性的調控更依賴 CaM/Ca2+，而從原核表達體系內純化的 CaMKKβ 在上述三個位點并未被磷酸化，所以其自主活性較高，活性的調控對 CaM/Ca2+依賴性較低。本實驗構建原核表達載體 pET28a-CaMKKβ，將其轉化入BL(DE3) 內，IPTG 誘導后經 Ni-NTA 親和層析純化得到純度達 80% 以上的重組人 CaMKKβ 蛋白，經 Glo? Max Assay 檢測，結果發現 CaMKKβ 重組蛋白在 CaM/Ca2+存在與否的條件下，酶活基本一致，此結果也驗證了在大腸桿菌系統內重組表達的人 CaMKKβ 自主酶活性較強，受 CaM/Ca2+影響較小，為后期的人 CaMKKβ 蛋白結構、活性研究及針對此靶點的藥物篩選模型建立和藥物發現提供了理論基礎。

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Prokaryotic expression, purification and activity assay of human CaMKKβ protein

LIU Ya-jin, TAN Chu-bing, SHI Li-li, PAN Xiao-fei, XU Wei-ren

To facilitate drug discovery based on CaMKKβ and AMPK, cloning, expression and purification of human CaMKKβ were performed in.

Human CaMKKβ gene was cloned to bacterial expression vector pET28a-CaMKKβ, and then transformed intoRosetta(DE3) cells. The recombinant CaMKKβ protein was induced with 0.02 mmol/L IPTG at 16 ℃, 6His-CaMKKβ was purified through Ni-NTA chromatography and activity was assessed by Glo? Max Assay.

The expression vector pET28a-CaMKKβ was confirmed via DNA sequencing. After optimization of induction condition, recombinant human CaMKKβ protein was expressed at high level mainly as soluble form. Single step Ni-NTA chromatography generated high purity product (greater than 80%). Activity analysis revealed that CaM/Ca2+did not modulate the enzymatic activity of recominant CaMKKβ.

pET28a-CaMKKβ vector is constructed successfully. Recombinant human CaMKKβ is purificatied by Ni-NTA, and strong autonomous activity of recombinant CaMKKβ expressed in prokaryotic system is not affected by CaM/Ca2+.

Ca(2+)-calmodulin dependent protein kinase; AMP-activated protein kinase; Chromatogrophy affinity; CaM/Ca2+

SHI Li-li, Email: shill@tjipr.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.009

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（13JCQNJC13700、12JCYBJC18800）

時麗麗，Email：shill@tjipr.com

2013-11-19

Author Affiliations: Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China (LIU Ya-jin, PAN Xiao-fei), Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China (TAN Chu-bing, SHI Li-li, XU Wei-ren)