PCR技術在城市空氣衛生檢測中的應用

王麗華，徐振強

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PCR技術在城市空氣衛生檢測中的應用

王麗華，徐振強

100076 北京航天總醫院血液腫瘤研究所（王麗華）；100048 北京，中國城市科學研究會（徐振強）

世界衛生組織（WHO）在 1994 年提出了健康城市的定義：“健康城市應該是一個不斷開發、發展自然和社會環境，并不斷擴大社會資源，使人們在享受生命和充分發揮潛能方面能夠互相支持的城市”。國外中大型城市正在通過改善城市空氣品質來逐步實現該目標。然而，我國城市空氣質量相當嚴峻，城市離健康標準仍有較大差距，廣泛存在以顆粒物 2.5（particulate matter 2.5，PM 2.5）為核心的灰霾污染。生物氣溶膠作為 PM 2.5 的重要組成部分，是指懸浮于氣態介質中生物來源的顆粒物，包括細菌、真菌、病毒和它們的副產物等，直接影響城市空氣衛生質量。生物氣溶膠無處不在，通過呼吸暴露會造成諸多負面健康效應，如肺功能障礙、哮喘、傳染性和過敏性疾病等。與此同時，伴隨城鎮化的穩步推進、城市人口的高密度集聚和生產生活方式的改變，城市空氣衛生污染作為 PM 2.5 危害的核心組成部分，對人群健康構成的潛在暴露風險日益凸顯。空氣生物衛生質量的檢測是表征其暴露風險的關鍵步驟。本文系統介紹了國內外在空氣微生物離線檢測的若干經典和先進技術手段，并結合當前空氣衛生監管的需要進行評價，為國內相關衛生機構提升檢測水平提供參考。

1 聚合酶鏈式反應法在空氣生物衛生檢測中的應用

聚合酶鏈式反應（PCR）法又稱無細胞分子克隆系統或基因擴增技術，出現于 1988 年，是微生物學研究領域的重大創新[1]。PCR 僅需要極少量的目標 DNA 就可以針對性地擴增上百萬次，檢測限顯著降低，可以對微量的生物氣溶膠進行檢測，并且 PCR 擴增針對的是所有的生物氣溶膠，不僅包含可培養部分還包括不可培養的部分。從理論上講，PCR 可以檢測單分子 DNA 或者一個目標 DNA 分子。在分子生物學技術中，隨著 PCR、qPCR 和 RT-PCR 等技術的發展，近年也越來越多地應用于空氣樣品中生物細胞的分析研究[2]。這些技術可以用聚合酶將環境樣品中提取的少量 DNA 或 RNA 片段擴增，并且其初始濃度可以用 DNA 標準樣品和它們熒光水平的循環閾值——Ct 值來測定。PCR 技術不僅可以顯著降低空氣樣品中生物氣溶膠的檢出限，還可以極大縮短獲得充足的空氣樣品所需的采樣時間。研究表明，qPCR 的檢出限為 50 ~ 100 bp/ml[3]。針對空氣中的微生物殘體和動物過敏原，由于缺乏完整的生命結構，因此無法用 qPCR 進行檢測，但是，檢出以上物質對于傳染源的監測十分重要。此外，DNA 樣品準備過程中可能的污染是這些技術應用的另一個重要問題。盡管如此，與傳統培養技術相比，使用基于 PCR 的技術可顯著降低生物氣溶膠的檢測限并縮短采樣時間。因此，近年來PCR 技術被廣泛用于生物氣溶膠，特別是病毒的檢測研究。關于聚合酶鏈式反應在生物氣溶膠科學中的應用如表 1 所示。隨著微納米加工工藝水平的發展，出現了將傳統的 PCR 系統縮小體積與采樣系統集成到芯片實現微型化的技術，應用該技術能夠檢出豬圈空氣中的流感病毒[4]。

PCR 在生物氣溶膠檢測的研究中，引物的選擇至關重要[13]。以室內生物氣溶膠為例，有文獻報道，選擇了 53 種引物來研究它們的擴增效果，最終分別篩選出了 3 對和12 對細菌氣溶膠和真菌氣溶膠的通用引物。表 2 列出了在生物氣溶膠研究中經常用到的引物。

表 1 聚合酶鏈式反應在生物氣溶膠科學中的應用

表 2 生物氣溶膠研究中常用的聚合酶鏈式反應引物

除了以上總結的技術方法外，其他與 PCR 聯用的手段，如變形梯度凝膠電泳（DGGE）和末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）也越來越多地應用于微生物氣溶膠多態性的分析中[20-21]。DGGE 是一個通過化學試劑梯度分離 DNA 片段的電泳過程。Haukka[22]于 1999 年就曾指出，DGGE 方法可用于空氣中生物氣溶膠的研究。然而，直到 2007 年，PCR-DGGE 技術才真正在生物氣溶膠領域開始得到應用[23]。隨后，該技術在生物采樣器對比[6]、生物氣溶膠外場觀測[24]、生物氣溶膠的滅活等方面得到廣泛應用，并且越來越多地應用于描述使用不同采樣工具采集、從不同地理位置獲得以及用不同方法滅活的生物氣溶膠樣品之間的微生物多樣性的差異。表 3 總結了近年來 PCR-DGGE 技術的應用情況。T-RFLP 技術融合了 PCR、RFLP 技術和 DNA 測序技術，是一種全新、快速、有效的微生物群落結構分析方法，可以描述微生物群落。這一方法也應用于研究空氣中的微生物結構[20]。

表 3 PCR-DGGE 在生物氣溶膠領域的應用

2 基于 PCR 法檢測空氣微生物的優勢分析

近年來，PCR、qPCR 和 RT-PCR 技術越來越多地用于生物氣溶膠的分析[3-9]。使用這些技術不僅顯著降低了生物氣溶膠的空氣樣本檢測限，還可以降低采樣時間，減少空氣樣本體積。qPCR 檢測限是 50 ~ 100 拷貝/μl。研究表明，qPCR 能夠檢測出細菌氣溶膠濃度差異在 1.3 ~3.2 倍之間的樣品[26]。除了細菌和病毒的鑒定外，PCR 技術還被廣泛應用于空氣樣本中真菌孢子的分析[27]。

3 結語

將 PCR 技術和生物氣膠的采集技術聯用在近年的文獻中得到較為全面的論述[6]。當然，這些微生物研究手段也有其自身的局限性，如 DNA 的提取、環境變量矩陣、冗長的檢測時間和較大的實驗勞動負荷等[2]。此外，微生物和動物的過敏原無法使用定量 PCR 分析，并且該技術沒有提供關于生物氣溶膠活性方面的信息，而這方面的信息對于傳染源的識別是非常重要的。此外，在 DNA 樣品制備中造成的人為污染也是一個重要的技術問題。盡管如此，PCR 技術與傳統的培養方法相比，大大降低了檢測限，是生物氣溶膠檢測領域的里程碑。培養、顯微鏡觀察和 PCR 是微生物鑒定檢測的金標方法，其中 PCR 方法由于基于基因尺度，具有較高的特異性和超低的檢測限，是空氣衛生檢測的核心方法。在生物氣溶膠的 PCR 方法檢測過程中，需要進一步做如下優化：

⑴鑒于生物氣溶膠樣品在采樣過程中不可避免引入的雜質干擾和濃度水平較低的特性，需要對生物氣溶膠樣品進行必要的前處理，并在 PCR 實驗中進行條件優化[2, 4, 12]；

⑵DGGE 作為微生物多態性研究的技術手段，能夠直觀地反映不同環境中生物氣溶膠的暴露特征[13]，將其引入到對生物氣溶膠的種類的多態性研究中，可直觀地用于分析環境生物氣溶膠的暴露風險，特別是與分粒徑的采樣裝置聯用，開展分粒徑差異的人群吸入風險研究，尤其是針對PM 2.5 和 PM 1.1 以下空氣動力學直徑的粒子；

⑶當前的 PCR 衛生檢測，主要是針對單種或若干種致病性微生物的檢測，近年來出現了基于通用引物的擴增檢測分析，但得到的結果中存在非致病性微生物，因此存在高估空氣暴露衛生風險的可能，并且缺少與直接致病相關的暴露特征，因此，需建立空氣微生物種群譜圖研究，進一步通過基因測序和生物信息學手段，設計一系列與健康相關的 PCR 引物，結合微型點陣 PCR 技術，實現在芯片上的快速檢測分析。

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徐振強，Email：xuzhenqiang@chinasus.org

2013-12-14

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.011