CRP、qPCR、組織病理學(xué)冰凍和石蠟切片評價在診斷假體關(guān)節(jié)感染中的應(yīng)用

張延輝，劉琳琳，郝琳娜

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CRP、qPCR、組織病理學(xué)冰凍和石蠟切片評價在診斷假體關(guān)節(jié)感染中的應(yīng)用

張延輝，劉琳琳，郝琳娜

157011 黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院骨外科（張延輝），超聲科（劉琳琳），眼科（郝琳娜）

假體周圍關(guān)節(jié)感染（periprosthetic joint infection，PJI）是髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)手術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，一旦發(fā)生，常常給患者造成災(zāi)難性后果，而且長期抗感染及多次手術(shù)將極大地增加患者經(jīng)濟負(fù)擔(dān)并影響關(guān)節(jié)功能[1]。PJI在診斷方面仍然非常困難[2]，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)在很長一段時間被視為診斷 PJI 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，最近的研究表明，這種方法的準(zhǔn)確性有限，尤其在低度感染時，常引起假陰性結(jié)果[3]。所以迫切需要一個更準(zhǔn)確的診斷方法。唐浩和周一新[4]報道，如果符合以下標(biāo)準(zhǔn)，可以認(rèn)為 PJI 明確存在：①存在與假體相通的竇道；②受累人工關(guān)節(jié)的 2 處假體周圍組織或關(guān)節(jié)液標(biāo)本中分離出同一病原體；③滿足以下 6 條中的 4 條：紅細(xì)胞沉降率（ESR）或 C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平升高、滑膜白細(xì)胞計數(shù)升高、滑膜中性粒細(xì)胞（PMN）百分比升高、受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)化膿表現(xiàn)、假體周圍組織或關(guān)節(jié)液標(biāo)本中 1 次培養(yǎng)分離出細(xì)菌、400 倍放大率下，假體周圍組織的病理學(xué)分析在每高倍顯微視野下發(fā)現(xiàn)大于 5 個 PMN。

對于 PJI 的診斷，我們采用血清 CRP檢測作為術(shù)前診斷工具，病理組織學(xué)冰凍切片評價和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）為術(shù)中診斷工具，組織病理學(xué)評估和細(xì)菌培養(yǎng)為術(shù)后診斷工具。Esteban 等[5]曾報道，術(shù)中qPCR 診斷 PJI 被認(rèn)為是能夠特異性識別甲氧西林耐藥菌的快速方法。組織病理學(xué)評價由于其特異性高常作為細(xì)菌性感染的可靠診斷，但 Kanner 等[6]的報道表明，冰凍切片分析靈敏性低。在本研究中，比較了每一個診斷試驗的特性，包括術(shù)前血清 CRP、qPCR、組織病理學(xué)冰凍和石蠟切片的敏感性和特異性，以及在診斷臨床 PJI 病例中的應(yīng)用，以文獻(xiàn)[4]報道標(biāo)準(zhǔn)為最終的診斷參考。

1 對象和方法

1.1 研究對象

86 例手術(shù)患者均來自 2008 年 1 月 – 2013 年 6 月牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，其中 63 例髖關(guān)節(jié)手術(shù)患者，23 例膝關(guān)節(jié)手術(shù)患者。86 例手術(shù)患者中有 10 例因懷疑有感染或無菌性松動行清創(chuàng)手術(shù)，15 例進行 1 周抗生素治療。所有病例，手術(shù)之前檢測血清 CRP，術(shù)中收集組織樣品標(biāo)本（髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié) 3 個不同的部位）用于qPCR、組織病理學(xué)檢查（冰凍和石蠟組織切片）以及細(xì)菌培養(yǎng)。考慮到對試驗的可能影響，排除 5 例炎癥性疾病病例，包括 2 例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，2 例惡性腫瘤，1 例系統(tǒng)性紅斑狼瘡。因此，本研究對其余 81 例患者PJI 情況進行分析。

1.2 主要儀器和試劑

VC 750 超聲破碎儀購自美國 Sonics 公司；DNA純化柱購自愛西默（中國）股份有限公司；LightCycler 96 實時熒光定量 PCR 儀購自瑞士 Roche 公司；BX53光學(xué)顯微鏡購自日本 Olympus 公司；徠卡 2165 旋轉(zhuǎn)式切片機購自德國 Nussloch 公司；CRP 的 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；標(biāo)準(zhǔn)肉湯培養(yǎng)基購自上海研生生化試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 血清 CRP 檢測 所有患者抽取外周靜脈血，采用 ELISA 法測定 CRP，設(shè)置截斷值 1.0 mg/dl 作為 PJI 診斷的節(jié)點。

1.3.2 qPCR 參照文獻(xiàn)[7-8]的方法。按照 DNA 提取試劑盒說明進行 DNA 提取，將從手術(shù)室采取的髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)3 個不同部位的樣品置于 1 ml 無菌水中，使用 40 kHz頻率超聲粉碎 5 min。然后使用 DNA 純化柱對超聲處理的溶液進行純化。qPCR 方法檢測細(xì)菌中 16s rRNA 基因及定量分析，使用qPCR方法特異性檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌特異性 mecA 基因。臨床樣本和陰性對照之間閾值的差值（ΔCT）主要基于 LightCycler 定量模式計算。如果 ΔCT 值超過 1.9 或者至少在 1 個樣品檢測到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，即可認(rèn)為該病例被感染。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察 術(shù)中冰凍切片和術(shù)后石蠟組織切片的組織病理學(xué)分析由本院病理科進行。每高倍顯微視野（400 ×）超過 5 個 PMN 可診斷為 PJI。

1.3.4 細(xì)菌培養(yǎng) 使用標(biāo)準(zhǔn)肉湯培養(yǎng)基對所有的標(biāo)本進行細(xì)菌培養(yǎng)，如果 2 個或 2 個以上不同的組織或關(guān)節(jié)液樣品中培養(yǎng)出同樣的細(xì)菌，將培養(yǎng)物記為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以例數(shù)（n）表示，統(tǒng)計軟件為 SPSS 17.0，計量資料采用檢驗，< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用 ROC 曲線取截斷值的數(shù)據(jù)分析方法，確定 CRP 的截斷值，并計算術(shù)前血清 CRP 值、qPCR、冰凍和石蠟切片組織病理學(xué)的敏感性、特異性、陰性似然比、陽性似然比[9]。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前血清 CRP、qPCR、冰凍和石蠟切片組織病理學(xué)及細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

術(shù)前血清 CRP 結(jié)果中，61 例小于 1.0 mg/dl，20 例大于 1.0 mg/dl，平均 CRP 值為 1.7 mg/dl。qPCR 結(jié)果中，33 例呈陰性，48 例呈陽性。病理組織冰凍切片結(jié)果中，59 例呈陰性，22 例呈陽性。病理組織石蠟切片結(jié)果中，63 例呈陰性，18 例呈陽性。微生物培養(yǎng)結(jié)果中，71 例呈陰性，10 例呈陽性。10 例微生物培養(yǎng)陽性患者的qPCR、組織病理學(xué)、術(shù)前血清 CRP 的相應(yīng)結(jié)果見表 1。手術(shù)前接受抗生素治療的 15 例患者，3 例細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性結(jié)果，并且呈高血清 CRP 值（大于 9.0 mg/dl）。12 例細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性結(jié)果，但是qPCR 檢測出其中 9 例呈陽性。

表 1 10 例細(xì)菌培養(yǎng)陽性樣品的 qPCR、組織病理學(xué)和術(shù)前血清 CRP 的結(jié)果

2.2 術(shù)前血清 CRP、qPCR、冰凍和石蠟切片組織病理學(xué)靈敏性、特異性考察

術(shù)前血清 CRP 診斷的靈敏性為 90%，特異性為 85%；qPCR診斷的靈敏性為 90%，特異性為 45%；病理組織冰凍切片診斷的靈敏性為 71%，特異性為 89%；病理組織石蠟切片診斷的靈敏性為 90%，特異性為 87%，結(jié)果見表 2。

2.3 術(shù)前血清 CRP、qPCR、冰凍和石蠟切片組織病理學(xué)陽性似然比、陰性似然比

術(shù)前血清 CRP 陽性結(jié)果似然比為 5.8，陰性結(jié)果似然比為 0.12；qPCR陽性結(jié)果似然比為 1.6，陰性結(jié)果似然比為 0.18；病理組織冰凍切片陽性結(jié)果似然比為 6.6，陰性結(jié)果似然比為 0.32；病理組織石蠟切片陽性結(jié)果似然比為 7.1，陰性結(jié)果似然比為 0.11，結(jié)果見表 3。

2.4 典型病例

表 1 中病例 2 的患者術(shù)前血清 CRP 值為 0.42 mg/dl，懷疑有 PJI。術(shù)中冰凍切片病理組織學(xué)結(jié)果為陰性，但實時qPCR 檢測結(jié)果顯示陽性，因此確診感染并取出假體。此外，石蠟切片組織病理學(xué)呈陽性，細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林表皮葡萄球菌。

表 2 術(shù)前血清 CRP、qPCR、組織病理學(xué)冰凍和石蠟切片的靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值

表 3 術(shù)前血清 CRP、qPCR、冰凍和石蠟切片組織病理學(xué)陽性似然比、陰性似然比、診斷優(yōu)勢比和 95% 置信區(qū)間

表 1 中的病例 8 是典型 PJI患者，其術(shù)前血清 CRP 值為 1.5 mg/dl，術(shù)中石蠟切片組織病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大量的滑膜中性粒細(xì)胞，故取出假體。正如預(yù)期的那樣，qPCR 檢測結(jié)果也呈陽性。術(shù)后石蠟切片病理結(jié)果與術(shù)中發(fā)現(xiàn)一致，細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)鏈球菌。

3 討論

不同的診斷試驗方法具有不同的敏感性和特異性。故此，幾種不同試驗方法的結(jié)合應(yīng)用是準(zhǔn)確診斷 PJI 必不可少的。臨床指南建議紅細(xì)胞沉降率、術(shù)前血清 CRP 檢測、術(shù)中組織病理學(xué)冰凍切片用于 PJI 評價[10]。本研究比較了術(shù)前血清 CRP、qPCR、組織病理學(xué)冰凍和石蠟切片與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果在診斷 PJI 中的應(yīng)用。

術(shù)前血清 CRP 檢測對 PJI 的診斷具有重要意義，該檢測有足夠的靈敏性和特異性，最近的臨床指南推薦其截斷值為 1.0 mg /dl。大多數(shù)醫(yī)院可以進行該項檢測，因此，推薦術(shù)前血清 CRP 為 PJI 診斷的最佳方式。當(dāng)其與 ESR 結(jié)合應(yīng)用，結(jié)果更加準(zhǔn)確[10]。ESR > 30 mm/h 以及 CRP >1.0 mg/dl 被認(rèn)為感染水平升高[4]。基于術(shù)前血清 CRP 或 ESR 的結(jié)果懷疑有 PJI 時，要進行其他實驗室檢查，比如關(guān)節(jié)穿刺抽液。qPCR檢測病毒或細(xì)菌感染已經(jīng)應(yīng)用到很多領(lǐng)域。Kobayashi 等[11]報道，通過qPCR鑒定細(xì)菌的 DNA 對診斷 PJI 有應(yīng)用價值，其靈敏性為 87%，特異性為 80%。而且qPCR還可用于 PJI 的定量評價。可以肯定，術(shù)前血清 CRP 值、qPCR、細(xì)菌培養(yǎng)與組織病理學(xué)的結(jié)果呈正相關(guān)。

一般情況下，術(shù)中懷疑 PJI 的患者應(yīng)采用冰凍切片分析。有研究表明，冰凍切片中 PMN 對于診斷 PJI具有較高的實用性，PMN 越多，PJI 的幾率越大[12]。然而另有研究表明，冰凍切片分析的靈敏性低[6]。因此，應(yīng)該尋找包括qPCR 在內(nèi)的更高靈敏性的測試方法。

本研究證實，術(shù)前血清 CRP 靈敏性與qPCR相當(dāng)，其高特異性接近于組織病理學(xué)評價，支持臨床指南建議使用術(shù)前血清 CRP 為 PJI的術(shù)前篩查[10]。至于 PJI 的診斷，本研究發(fā)現(xiàn)，qPCR以其靈敏性高，良好的陰性似然比，對感染的篩查有應(yīng)用價值，而組織病理學(xué)評價以其優(yōu)良的特異性和良好的陽性似然比，適用于感染的明確診斷。qPCR的靈敏性與組織病理學(xué)的特異性成為術(shù)中診斷 PJI的合理組合。

偶爾出現(xiàn)的問題是qPCR檢測呈陽性病例而組織病理學(xué)顯示陰性，反之亦然。這種矛盾的結(jié)果可能由諸如術(shù)前抗生素治療或低致病細(xì)菌感染等因素所致。在這種情況下，每一個診斷試驗的特性應(yīng)予以考慮。例如病例 2 的患者，不能簡單地依據(jù)血清 CRP 值和組織病理學(xué)結(jié)果診斷為感染，還應(yīng)參考qPCR的結(jié)果。另一方面，術(shù)前評價高度懷疑感染的患者，例如病例 8 的患者，組織病理學(xué)陽性結(jié)果對于明確診斷很重要。

組織病理學(xué)研究目前允許比較冰凍和石蠟切片。通常，冰凍和石蠟切片結(jié)果之間的差異可能由于切片質(zhì)量差異引起。有研究表明，冰凍切片分析與石蠟切片分析結(jié)果一致，而另一份研究顯示，兩者的一致率較低。Stroh 等[13]報道了較高的一致率為 97%，其中，平均每高倍視野大于 5 個多形核白細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)的陽性診斷。Tohtz 等[14]報道了相對較低的一致率為 78%。盡管冰凍切片分析比石蠟切片分析靈敏性低，但是，本研究證實了它具有高特異性的特點。故此，冰凍切片分析更適合于 PJI的明確診斷。

本研究的局限性是可能忽略細(xì)菌培養(yǎng)陰性的病例。細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性，但組織病理學(xué)或qPCR呈陽性的病例也是存在的。本研究中，有 4 例術(shù)前血清 CRP、qPCR和組織病理學(xué)檢查均呈陽性，但細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性結(jié)果的病例，這可能是低度感染所致。另外抗生素的應(yīng)用對結(jié)果的影響應(yīng)予以考慮。抗生素治療可能影響細(xì)菌培養(yǎng)、qPCR和組織病理學(xué)結(jié)果。另外，必須考慮潛在的炎癥對實驗結(jié)果的影響，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。故此，本研究排除了 5 例這樣的患者。

綜上所述，本研究證明以下 3 點：首先，術(shù)前血清 CRP 以其靈敏性高被肯定為有價值的術(shù)前篩查 PJI 試驗；第二，qPCR 和組織病理學(xué)冰凍切片評價在診斷 PJI 中扮演重要角色，同時使用幾種方法診斷 PJI 時考慮其不同的特點做出正確判斷是非常重要的；第三，組織病理學(xué)冰凍切片盡管靈敏性較低，但特異性高，結(jié)果等同于石蠟切片。

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張延輝，Email：yanhuizhang@126.com

2014-02-07

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.013