吸濕回干法提高冬凌草種子抗旱性的研究△

董誠明，喬毅琳，李明丹，李洋，冷慕嬋，曹利華

(河南中醫學院，河南 鄭州 450046)

吸濕回干法提高冬凌草種子抗旱性的研究△

董誠明*，喬毅琳，李明丹，李洋，冷慕嬋，曹利華

(河南中醫學院，河南 鄭州 450046)

目的采用PEG-6000溶液模擬干旱條件處理經過吸濕回干法鍛煉的冬凌草種子，篩選出提高冬凌草種子抗旱性的方法。方法用PEG-6000溶液模擬干旱條件；用吸濕回干法對種子進行干旱鍛煉；并分別采用考馬斯亮藍G-250染色法、愈創木酚法、硫代巴比妥法測其生理指標可溶性蛋白含量、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)活性。結果吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項的POD含量最高，吸濕1 h干旱鍛煉2次次之，吸濕2 h干旱鍛煉4次最低，并且吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項的MDA含量均低于對照組，說明經過這兩項的處理種子的生活力增強，即抗旱性增強。結論吸濕回干法可以提高冬凌草種子的發芽率，最好的處理項是吸濕4 h干旱鍛煉1次。

冬凌草種子；PEG-6000溶液；抗旱性；可溶性蛋白；過氧化物酶；丙二醛；吸濕回干法

冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara為唇形科Lamiaceae香茶菜屬植物，以全株入藥。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清熱解毒，消炎止痛，健胃活血及抗腫瘤之功效[1]。藥用冬凌草主產于河南濟源太行山、王屋山地區[2]。冬凌草多處于野生狀態，太行山區石多土少，氣候干燥，生長環境較差，因此產量很不穩定[3]。1991年我國衛生部批準將其干燥葉及地上部分作為中藥材，收入部頒中藥材標準，臨床用藥量很大，但是冬凌草種子的產量卻不高，冬凌草種子抗旱性方面的研究也很少，然而仔細研究太行山區的氣候條件不難發現干旱對冬凌草種子的生長及有效成分的含量高低有很大的影響。因此，通過科學的評價體系研究冬凌草種子的抗旱性是十分有必要的。

干旱鍛煉是指將植物處于一種致死量以下的干旱條件中，讓植物經受干旱磨煉，以提高其對干旱的適應能力，是農業生產中常用的并且經濟有效的提高作物抗旱性的方法之一[4]。植物對干旱脅迫的適應過程和受傷害程度與干旱脅迫的強度以及植物自身的抗性緊密聯系，并以生化代謝、生理功能、形態適應、生長發育以及生物生產力等多種形式表現出來[5]。因此種子的抗旱性與發芽后幼苗中各種保護酶及蛋白質的含量有一定的相關性。本課題通過測量比較各處理項中保護酶及蛋白質含量的變化，總結與冬凌草種子抗旱性相關的保護酶含量的變化規律，從而選出可以有效提高其發芽率的干旱鍛煉方法。

1 儀器與試劑

光照培養箱(SPX-250-GB，上海躍進醫療器械廠)；紫外分光光度計(美譜達儀器 UV-3200S系列)；高速冷凍離心機(KDC-160HR，科大創新股份有限公司中佳分公司)。

PEG-6000(天津市科密歐化學試劑有限公司)；Tris(上海藍季科技發展有限公司)；愈創木酚(天津市科密歐化學試劑開發中心)；2-硫代巴比妥酸(上海遠帆助劑廠)；甘油；β-巰基乙醇(Amresco)；考馬斯亮藍G-250(中國醫藥集團上海化學試劑公司)；牛血清白蛋白(AD0023生工生物)。

2 材料與方法

實驗材料為2012年采收的濟源成熟冬凌草種子，經河南中醫學院董誠明教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara的種子。

2.1 PEG-6000溶液模擬干旱條件處理冬凌草種子

精選成熟飽滿冬凌草種子，經2%次氯酸鈉消毒15 min，蒸餾水反復沖洗數次直至沒有次氯酸鈉溶液的味道為止，均勻平鋪在直徑為10 cm的培養皿內，水分脅迫條件由PEG-6000溶液產生，質量濃度分別為0%、5%、10%、15%、，放在溫度(25±1) ℃的培養箱中培養，培養五天后測其發芽率、MDA、POD及可溶性蛋白含量。

2.2 吸濕回干法模擬干旱鍛煉處理冬凌草種子

精選成熟飽滿的冬凌草種子，用吸濕回干法對冬凌草種子進行干旱鍛煉。以蒸餾水為介質進行浸種，并以吸濕時間1 h、2 h、3 h、4 h設置四個處理項，每個處理項設置5組(每組100粒)，第一組種子經一次充分吸脹后在室溫下干燥至原重量作為一次干旱鍛煉，第二組種子同法進行兩次干旱鍛煉，第三組和第四組以此類推進行三次、四次干旱鍛煉。第五組種子作為空白對照不進行干旱鍛煉。將上述處理項在溫度(25±1) ℃的培養箱中培養，五天后測其發芽率。

2.3 種子經吸濕回干法處理后抗旱性的測試

選擇2.2項下中發芽率最好的三個處理項，即吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕2 h干旱鍛煉4次、吸濕4 h干旱鍛煉1次的種子，分別用PEG-6000溶液0%、5%、10%對以上3組進行干旱脅迫處理，對照組為不經處理的種子。各處理項種子放在溫度(25±1) ℃的培養箱中培養五天。

2.3.1 用考馬斯亮藍G-250染色法測量冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量[6]

2.3.2用硫代巴比妥法測量冬凌草幼苗中MDA含量[7]

2.3.3用愈創木酚法測量冬凌草幼苗中POD含量[8]

3 結果

3.1 PEG-6000溶液模擬干旱條件對冬凌草種子的影響

通過對冬凌草幼苗的發芽率、可溶性蛋白質含量、MDA活性、POD活性的比較，綜合各項因素選擇5%及10% PEG-6000溶液作為干旱脅迫條件。見表1。

表1 不同濃度PEG-6000對冬凌草種子影響

3.2 吸濕回干法模擬干旱鍛煉對冬凌草種子發芽率的影響

綜合種子發芽率、吸濕時間、回干次數、操作可行性及簡便程度等各項因素，選擇發芽率較高的吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕2 h干旱鍛煉4次、吸濕4 h干旱鍛煉1次3個處理項，進行抗旱性測試，結果見表2。

表2 吸濕回干各處理項種子的發芽率

3.3 種子經吸濕回干法處理后抗旱性的測試結果

3.3.1 吸濕回干法與干旱模擬結合對冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影響 吸濕回干實驗中吸濕1 h、2 h、4 h 3個處理項可溶性蛋白的含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加；0 %、5 % PEG-6000溶液培養的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量均比原始樣品稍低，10 % PEG-6000溶液培養的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量比原始樣品高，結果見表3。

3.3.2 吸濕回干法與干旱模擬結合對冬凌草幼苗中MDA含量的影響 吸濕回干實驗中吸濕1 h、2 h、4 h三個處理項中MDA含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加，對比PEG-6000溶液濃度可看出吸濕1 h、4 h處理項的冬凌草幼苗中MDA含量比吸濕2 h低，并且均比原始樣品含量低，結果見表4。

3.3.3 吸濕回干法與干旱模擬結合對冬凌草幼苗中POD含量的影響 吸濕回干實驗中吸濕1 h、2 h、4 h三個處理項中POD含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加，對比PEG-6000溶液濃度可看出5%、10 % PEG-6000溶液培養的冬凌草幼苗中吸濕1 h、4 h處理項下POD含量比5 %PEG-6000溶液高，結果見表5。

表3 吸濕回干法與模擬干旱結合對冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影響

表4 吸濕回干法與模擬干旱結合對冬凌草幼苗中MDA含量的影響

表5 吸濕回干法與模擬干旱結合對冬凌草幼苗中POD含量的影響

4 討論

冬凌草種子活力下降的原因與其生理生化指標的變化有關[6]，種子抗旱性的高低可以間接反映出種子活力的大小，即活力強的種子抗旱性高。冬凌草種子活力與可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相關，與MDA含量呈負相關，說明冬凌草中的抗旱性與可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相關，與MDA含量呈負相關。根據實驗測得的各項指標的含量可知通過吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次的種子抗旱性相對較強。

本次實驗在發芽率較高的3個處理項的各保護酶含量測定過程中，發現吸濕1 h干旱鍛煉2次處理所得幼苗的根長，三個濃度項均是對照組的一倍左右，吸濕4 h干旱鍛煉1次次之，但是依然比對照組長，吸濕2 h干旱鍛煉4次處理項較對照組短，且須根極少；3個處理項在相同培養時間里吸濕4 h干旱鍛煉1次的子葉長勢明顯優于其他兩項。從而更有利的說明吸濕2 h干旱鍛煉4次處理項對種子發芽時根系的生長有抑制作用，抗旱性相對較低，而吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項的抗旱性比對照組增強。

[1] 鄭虎占，董澤宏，佘靖.中國現代化研究與應用[M].北京學苑出版社，1997(2)：1632.

[2] 鄭曉軻，董三麗，馮衛生.冬凌草的質量控制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2005，11(2)：10-13.

[3] 陳隨清，董誠明，馮衛生.太行山區冬凌草生態環境及生物學特性研究[J].中國野生植物資源.2005，24(4)：33-35.

[4] 譚曉榮，伏毅，戴媛，等.干旱鍛煉提高小麥幼苗抗旱性的抗氧化機理研究[J].作物雜志，2009，(5)：19-23.

[5] 李忠光，龔明.愈創木酚法測定植物過氧化物酶活性的改進[J].植物生理學通訊.2008，44(2)：323-324.

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ResearchonEnhancementofRabdosiarubescensSeedbyHydration-dyhydration

DONGChengming*，QIAOYilin，LIMingdan，LIYang，LENGMuchan，CAOLihua

(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：Using drought conditions in PEG-6000 solution to treatmentRabdosiarubescensseed after moisture to dry the exercise，screening the method to improve the drought resistance ofRabdosiarubescens.MethodsUse PEG-6000 solution simulate drought conditions；use the method of drought exercise on seed moisture ；And respectively by Coomassie brilliant blue G 250，guaiacol method，thiobarbituric acid method to measure the content of soluble protein，physiological index of peroxidase(POD)activity，malondialdehyde(MDA)activity.ResultsThe item of hygroscopic 4 h drought exercise 1 times was the highest in POD content，the item of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times lower，the item of hygroscopic 2 h drought exercise 4 times was the minimum.And the items of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times，hygroscopic 4 h drought 1 times were lower than the control group in MDA content treatment，suggesting that life force of seeds was enhanced after treatment of these two items，that is drought resistance of seeds was improved.ConclusionThe method of hydration-dyhydration can improve the germination rate ofRabdosiarubescensseed，the best processing item is hygroscopic 4 h exercise 1 times treatment.

Rabdosiarubescensseed；PEG-6000 simulation；Drought resistance；Soluble protein；Peroxidase；Malondialdehyde；Hydration-dyhydration

國家自然科學基金(81173486)；國家重大科技專項(2012ZX09304006)

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董誠明，教授，研究方向：中藥資源開發利用；Tel：(0371)86535313 ，E-mail：dcm663@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.010

2013-07-18)