HPLC法測定鮮食葡萄采后貯藏過程中糖分的變化?

林江麗，朱亞娟，王金霞，封順，王吉德

(新疆大學 化學化工學院，新疆石油天然氣精細化工教育部和自治區重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

葡萄果實中除水分之外，糖含量最高，其中以葡萄糖、果糖為主.葡萄果實在貯藏期間由于自身代謝，會消耗葡萄果實內的糖分[1].目前，市售葡萄大都采用SO2緩釋保鮮劑并輔以低溫貯藏，抑制酶活性以延長貯藏期，但SO2也能與葡萄果實中的還原糖等化合物發生反應[2]，這在一定程度上也影響貯藏過程中果實中糖含量的變化.

糖含量的檢測方法有比色法[3,4]，旋光法，氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]等.高效液相色譜法因其操作簡便，可快速、準確地分析各種單糖和多元醇，因此近年來用液相色譜法測定食品中糖的組成和含量得到了快速發展[7～11].關于葡萄中的白藜蘆醇，花青素及多酚等的研究報道較多，但對其糖分的測定未見報道.本實驗采用液相色譜法對不同時期，不同貯藏條件下鮮食葡萄中的糖分進行測定，并對不同貯藏期果實中糖含量的變化趨勢進行分析，為鮮食葡萄采后貯藏中葡萄風味品質的評價提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為新疆常見的紅提葡萄，采自新疆三坪農場紅提葡萄種植園.采摘后的葡萄采用兩種貯存方式：第一種方式為葡萄樣品直接進行低溫冷藏貯存（Blank）；第二種方式為葡萄樣品使用SO2緩釋型保鮮紙并輔以低溫冷藏貯存（SO2處理）.為了對鮮食葡萄樣品貯藏過程中糖分的變化規律進行研究，定時對兩種貯存方式的葡萄樣品進行采樣，直至葡萄樣品完全失去食用價值.

1.2 儀器和試劑

LC-10Avp高效液相色譜儀（日本SHIMADZU公司制造），Coulter Avanti J-25高速離心機（美國 BECKMAN公司制造），DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器（金壇市醫療儀器廠生產），葡萄糖，果糖，蔗糖為國產分析純，乙腈為Dikama公司色譜純，實驗用水均為電阻率不低于18.2 M?.cm?1的高純水.

1.3 標準溶液的配置

參照文獻[6]，準確稱取葡萄糖、果糖各0.500 0 g，共同轉移至100 mL容量瓶中，用高純水定容至刻度，得到葡萄糖、果糖濃度分別為5.00 mg/mL的混標貯液.用逐級稀釋法配制葡萄糖、果糖濃度為1.00～5.00 mg/mL的梯度混標溶液.同時配制葡萄糖、果糖濃度均為5.00 mg/mL的單標溶液，待測.

1.4 色譜分析條件

色譜柱：Inertsil NH2（5μm，4.6×250 mm）柱；柱溫：室溫；流動相：乙腈:水=75:25(v/v)；真空泵脫氣；流速：0.8 mL/min；進樣量：20μL.

1.5 樣品處理

準確稱取20.00 g葡萄樣品置于三角瓶中，加入30 mL高純水，80oC水浴15 min，冷卻后高速離心15 min，殘渣加入20 mL高純水再提取，合并上清液，定容至100 mL.用一次性注射器抽取提取樣液，過0.22μm濾膜過濾、NH2柱分析.每個樣品重復五次.

2 結果和討論

2.1 流動相和提取劑的選擇

根據葡萄糖和果糖分子的化學結構特點，我們選擇極性較大的溶劑水和乙腈作為流動相.由實驗結果可知，當乙腈和水的比例為75:25(v/v)時，葡萄糖和果糖得到很好的分離.

葡萄樣品中葡糖糖和果糖的提取溶劑選用水，文獻報道也有選用乙醇作為提取溶劑，但是兩者在分離效果、速度、以及準確度、回收率上并沒有明顯的差別，因此本實驗選用水做提取劑.

2.2 標準曲線的繪制

取葡萄糖、果糖標準溶液2、4、6、8、10 mL，分別用高純水定容至10 mL，從中分別取20μL進樣，采用HPLC-RI方法進行分析，以峰面積Y(mV)為縱坐標，標樣濃度X(mg/mL)為橫坐標，繪制標準溶液曲線，計算線性回歸方程.結果見表1

表1 線性回歸方程，相關系數，線性范圍

2.3 精密度實驗

對待測的鮮食葡萄提取液，同一樣品重復進樣五次，測定峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)來考查其測定的精密度，得出兩種糖的RSD為0.52%～1.22%，說明精密度良好.結果見表2.

表2 方法的精密度和回收率

2.4 回收率實驗

采用加標樣回收法，選取貯存30天的葡萄樣品，每樣取2份，一份加入果糖、葡萄糖的標樣，一份不加，按實驗方法平行測定五次，計算回收率(回收率為：添加標樣樣品的測出量減去樣品測出量，再除以加入的標樣量)，結果見表2.實驗表明兩種糖的平均回收率為99.81%～100.4%，說明該方法具有較高的準確度.

2.5 葡萄樣品的分析

按照上述色譜條件，將糖分標樣和葡萄樣品提取液進行液相色譜分析，進樣20.0μL，糖分標樣和葡萄樣品色譜圖如圖1.從圖1可知，葡萄果實中主要以葡萄糖、果糖為主，不含有蔗糖.同時對兩種不同貯藏方式（Blank和SO2）不同貯藏期的葡萄樣品提取液進行分析，根據測定的葡萄糖、果糖的色譜峰峰面積，代入工作曲線計算其含量，得到葡萄糖、果糖在貯藏60 d內的糖分變化趨勢如圖2.

從圖2可得，經SO2處理的葡萄果實在貯藏前7天含糖量較空白葡萄樣品要高，可能是由于SO2在保鮮過程中，抑制酶活性的變化，從而抑制糖代謝的過程；但是7天后呈逐漸下降的趨勢，其中葡萄糖含量的下降程度高于葡萄果實中果糖含量的下降趨勢，這可能是由于果實中的部分葡萄糖與SO2發生化學反應而使葡萄糖的含量發生變化.

圖1 葡萄樣品和糖分標樣色譜圖（1溶劑2葡萄糖3果糖4蔗糖）

圖2 貯藏期間葡萄糖和果糖含量的變化(貯藏溫度：0oC)

3 小結

本研究建立了高效液相色譜法測定葡萄果實中糖的組分和含量的方法，相關系數分別為0.997 3和0.999 3，相對標準偏差為0.52%～1.22%，加標回收率為99.81%～100.4%，是一種簡便、快速、準確的方法.本方法適于葡萄及葡萄制品中糖的組分及其含量分析，具有實用價值.