逍遙散干預肝損傷小鼠的代謝組學研究

張 寧，楊祎楠，劉海洋，王業秋，李建民，耿 放

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱 150025)

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，功效為疏肝解郁、健脾和營，是調和肝脾的經典方，臨床上廣泛用于肝損傷的治療。肝損傷是臨床常見的危害人類健康的疾病。代謝組學方法是從系統生物學角度研究相對分子質量1000以下的內源性小分子 (氨基酸、有機酸、糖類及脂肪酸等)受到外界干擾或擾動后的變化情況［1］。氣相色譜-質譜 (GCMS)具有高靈敏度、分離效果好及代謝物易于鑒定等優點，是近年來代謝組學主要的研究手段［2］。為了全面揭示逍遙散保肝、護肝的作用，本研究不僅檢測常用的各種血清酶指標，而且還借助代謝組學的方法，利用GC-MS分析小鼠肝組織勻漿及血清的代謝物譜，尋找潛在標記物。為臨床應用逍遙散治療肝損傷提供理論依據。

1 實驗材料及儀器

1.1 動物 雄性昆明種小鼠42只，體質量 (18～25)g，購自黑龍江中醫藥大學GLP實驗室 (實驗動物生產許可證號:SCXK(黑)2008-004)。

1.2 藥物及制備 處方飲片均購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店，經黑龍江中醫藥大學陳孝忠副教授鑒定。遵照《太平惠民和劑局方》原文，逍遙散的制備方法為:準確稱取柴胡15 g，當歸15 g，白芍15 g，白術15 g，茯苓15 g，甘草7.5 g，于中草藥粉碎機中粉碎成最粗粉，加水1500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL(按生藥量計)。

1.3 主要試劑 硅烷化試劑N-甲基-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺 (MSTFA)(Apollo Scientific Limited UK)，三甲基氯硅烷 (TMCS)(98%Acros Organics USA)，甲氧胺鹽酸鹽，二十二烷 (均購自Fluka公司);吡啶 (天津光復科技發展有限公司);正庚烷 (天津市申泰化學試劑有限公司);甲醇 (色譜級，購自Merck公司);丙氨酸氨基轉換酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉換酶 (AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)試劑盒均購自南京建成工程生物研究所;其他試劑均為分析純。

1.4 主要儀器 MS-500A型半自動生化分析儀 (成都美生科技有限公司);CTC自動進樣器及自帶頂空裝置 (瑞士CTC股份有限公司);Agilent6890N-5975B氣相色譜-質譜儀(美國安捷倫公司)。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥 將42只雄性小鼠隨機分為3組，即正常對照組、模型組、逍遙散組;逍遙散組按20 g/kg早晚給予逍遙散;正常對照組及模型組給予蒸餾水;連續給藥7 d。第7天末次給藥1 h后逍遙散組和模型組小鼠同時腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液 (10 mL/kg)，正常對照組腹腔注射等量花生油。

2.2 指標測定

2.2.1 小鼠血清中ALT、AST的活性測定 實驗第8天，摘除小鼠眼球取血，常規分離血清，按試劑盒說明書測定ALT、AST的水平。

2.2.2 小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA的水平測定 實驗第8天，處死小鼠后立即取出肝臟，常規制成肝組織勻漿，按試劑盒說明書測定SOD、MDA的水平。

2.2.3 小鼠肝組織病理形態學檢測 取完整肝臟中葉，10%甲醛固定。按常規方法制備切片，在光鏡下進行病理學檢查。

2.3 GC-MS樣品處理 取解凍后血清樣品100 μL(10%肝組織150 μL)，加入500 μL甲醇，旋渦3 min，冰浴30 min后離心 (10000 r/min，4℃，10 min)。取上清液450 μL(10%肝組織400 μL)置Eppendorf管中，N2吹干。加15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，渦旋混勻，密封后室溫下反應12 h，加衍生化試劑 (MSTFA∶TMCS=100∶1，V/V)75 μL，渦旋混勻，密封70℃反應1 h。室溫冷卻后加含二十二烷 (內標，0.10 mg/mL)的正庚烷150 μL，混勻后離心 (10000 r/min，4℃，10 min)，移取上清液置Eppendorf管中，供 GC-MS 分析［3-4］。

2.4 GC-MS分析條件 升溫程序:85℃保持5 min，以8℃/min升至 120℃，以 2℃/min升至 125℃，以 10℃/min升至190℃保持10 min，以10℃/min升至280℃保持7 min;進樣量1 μL，不分流進樣;載氣為高純氦氣，體積流量為1.0 mL/min;進樣口溫度為270℃;離子源溫度為230℃;四級桿溫度為150℃;調諧方式為自動調諧;掃描方式為全掃描;質量掃描范圍為30～600 aum;閾值為30。

2.5 數據處理 根據GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰，獲取各峰與內標峰的峰面積數據，用相對峰面積 (各峰與內標峰的比值)表示代謝物的量。各組模式識別采用主成分分析 (PCA)應用Matlab 7.0.1軟件。統計方差分析應用SPSS 18.0軟件。

3 結果

3.1 小鼠血清中ALT、AST活性的測定 與正常對照組相比，模型組小鼠血清ALT和AST活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組相比，逍遙散組血清ALT和AST活性顯著降低 (P＜0.01)。結果見表1。

表1 逍遙散對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(，n=8)

表1 逍遙散對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(，n=8)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 ALT/(IU·L－1) AST/(IU·L－1)22.96 ± 6.23 31.89 ± 7.26模型組 136.46±15.75＊＊ 145.37±16.39＊＊逍遙散組 89.38± 6.96## 119.04±20.44正常組#

3.2 小鼠肝組織勻漿SOD、MDA水平 與正常對照組小鼠相比，模型組肝組織勻漿SOD的活性顯著降低，MDA的活性明顯升高 (P＜0.01)。與模型組相比，逍遙散組肝組織MDA的活性顯著降低，SOD活性明顯升高 (P＜0.01)。結果見表2。

表2 逍遙散對急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性的影響(，n=8)

表2 逍遙散對急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性的影響(，n=8)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01

組 別 SOD/(IU·mg－1) MDA/(nmol·mg－1)336.73±25.34 4.22±1.08模型組 261.60±20.29＊＊ 17.48±3.45＊＊逍遙散組 304.77±31.71## 10.30±2.22正常組##

3.3 肝組織病理切片結果 正常對照組小鼠肝小葉結構正常、清晰，細胞排列整齊，大小均勻，細胞核位于細胞中央，圓而邊界清;模型組小鼠肝細胞明顯水腫，細胞核濃縮，部分細胞由多角形變為圓球形，胞質疏松呈網狀、半透明，細胞膜界不分明，排列紊亂擁擠，有嚴重的肝細胞壞死現象，可見明顯的結節狀再生細胞。與模型組比較，逍遙散組小鼠肝細胞水腫減輕，細胞排列較為整齊，結節狀再生細胞減少。結果見圖3。

圖3 肝損傷小鼠肝組織病理改變 (HE×400)

3.4 GC-MS分析結果 各峰挑選后發現血清中共有內源性代謝物38種。取同一樣品連續進樣6次，計算各相對峰面積的相對標準偏差 (RSD)。血清各峰的RSD為3.14%～14.37%。小鼠血清GC-MS分析總離子流圖見圖4所示。

圖4 小鼠血清GC-MS分析總離子流圖

3.5 代謝物鑒定 使用NIST05 a標準譜庫對共有的代謝物進行鑒定，一般認為匹配度大于800(最高值為1000)且可能性大于80%的鑒定結果較為可信。見表3。

3.6 代謝物譜模式識別及水平變化 將正常對照組與模型組血清中的所有內源性代謝物進行PCA(主成分分析)，主成分積分值集中分布在橢圓形散點圖的兩個區域，模型組明顯偏離正常對照組，無交叉和重疊，正常對照組分布在左方，模型組分布在右方。用T檢驗判斷各組代謝物水平差異，共有11個明顯差異代謝物。與正常對照組相比，模型組除肌醇升高 (P＜0.05)外，其他10個共有代謝物均明顯升高 (P＜0.01)。與模型組相比，逍遙散組丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、氨基丙二酸、蘋果酸、谷氨酰胺、賴氨酸、肌醇降低 (P＜0.05)，絲氨酸、天門冬氨酸、鳥氨酸明顯降低 (P＜0.01)。見表4及圖5。

4 討論

逍遙散常用于臨床慢性肝炎、肝硬化等肝損傷疾病的治療，對于其保肝護肝的藥效物質研究大多只停留在病理生理指標的檢測［5］，一兩個指標的變化只能從宏觀上證明逍遙散的干預作用，無法全面系統的揭示逍遙散的作用機制。代謝組學是研究生物體受到外界擾動后內源性代謝物動態變化的，可以從微觀的角度揭示逍遙散調節生物體各個系統發揮藥物療效的作用機制［6］。本實驗建立在CCl4致小鼠肝損傷模型的基礎上，首先檢測常規肝功能指標ALT、AST、SOD、MDA，證明肝損傷模型成功及逍遙散對特異指標的宏觀作用。然后參考黃欣等［8］樣品處理方法利用GCMS高通量、高精密度的優點從微觀方面對各組血清進行代謝組學研究，采用PCA方法對各組進行模式識別。最后以T檢驗尋找肝損傷發病機制及逍遙散干預作用的潛在標記物。

表3 小鼠血清內源性代謝物的鑒定

表4 各組血清中明顯差異代謝物變化 (，n=8)

表4 各組血清中明顯差異代謝物變化 (，n=8)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

正常組 逍遙散組 模型組Alannine 丙氨酸 6.667 0.417±0.078 0.584±0.074* 0.669±0.113化合物 中文名 保留時間/min##Glycine 甘氨酸 11.585 0.149±0.019 0.234±0.033* 0.338±0.077##Serine 絲氨酸 13.129 0.244±0.041 0.302±0.048＊＊ 0.352±0.058##Threonine 蘇氨酸 13.719 0.307±0.041 0.450±0.032* 0.546±0.070##Aminomalonic acid 氨基丙二酸 15.274 0.155±0.057 0.219±0.051* 0.296±0.045##Malic acid 蘋果酸 15.608 0.060±0.012 0.110±0.016* 0.189±0.073##Aspartic acid 天門冬氨酸 16.095 0.078±0.022 0.092±0.014＊＊ 0.099±0.050##Glutamine 谷氨酰胺 17.503 0.289±0.048 0.385±0.054* 0.531±0.133##Ornithine 鳥氨酸 20.238 0.055±0.013 0.214±0.044＊＊ 0.294±0.060##Lysine 賴氨酸 22.242 0.247±0.031 0.298±0.090* 0.550±0.167##Inositol 肌醇 27.914 0.423±0.043 0.491±0.136* 0.514±0.067#

研究表明，模型組小鼠血清ALT、AST明顯升高，證明肝損傷模型復制成功［7］;模型組肝組織勻漿SOD降低，MDA明顯升高，說明肝細胞發生脂質過氧化反應;肝細胞水腫、壞死，細胞排列紊亂，明顯可見結節狀再生細胞;灌胃給予逍遙散后，小鼠AST降低，ALT、MDA顯著降低，SOD升高;肝細胞水腫減輕，細胞排列較為整齊，結節狀再生細胞減少。推測逍遙散有降酶，抗脂質過氧化，促進細胞再生及修復細胞的作用。

肝臟是物質代謝的樞紐，同時也是氨基酸代謝的中心器官，當肝功能受損時，可導致氨基酸代謝過程的紊亂，實驗結果顯示在CCl4引起肝損傷時，模型組血清甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、鳥氨酸均明顯升高［8-10］。產生這些結果的原因可能是脂質過氧化作用，導致溶酶體酶大量釋放入血，組織蛋白分解加強，部分肝細胞結構破壞，使肝細胞合成蛋白質的功能降低，肝對氨基酸清除率降低，造成血中氨基酸水平明顯升高。另一方面受損的肝臟對胰高血糖素的滅活降低，導致內源性蛋白處于高分解狀態，釋放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高［11-12］。蘋果酸是三羧酸循環的中間產物，它的水平上升，可能是肝損傷狀態下體內三羧酸循環發生紊亂所致［13-14］。肌醇是一種水不溶性維生素，在相同的肝損傷報道中首次發現，其代表的生物學意義還需要進一步的實驗研究與驗證。

尿素循環是氮元素代謝與排泄的重要途徑。生物體內多余的氮首先轉化成氨，其中大部分氨再通過肝細胞尿素循環途徑轉化成無毒的尿素，也有一小部分的氨代謝為谷氨酰胺。在急性肝功能衰竭的情況下，尿素循環也被破壞，這就導致血清中尿素量的減少以及血氨水平的上升，從而激發谷氨酰胺的合成［15］。

逍遙散組丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、氨基丙二酸、蘋果酸、谷氨酰胺、賴氨酸、肌醇降低，絲氨酸、天門冬氨酸、鳥氨酸顯著降低。說明逍遙散能有效調節氨基酸的水平。綜上所述，推測逍遙散的作用機制是降酶，清除自由基，抑制脂質過氧化;有效調節三羧酸循環、尿素循環，使體內部分氨基酸及肌醇恢復正常。

［1］Nicholson J K，Lindon J C，Holmes E.‘Metabonomics':understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data［J］.Xenobiotica，1999，29(11):1181-1189.

［2］齊 煉，文李萍，趙 靜.代謝組學與中醫藥現代研究［J］.世界科學技術:中醫藥現代化，2006，8(6):79-86.

［3］黃 欣，龔益飛，王 毅，等.代謝組學方法研究水飛薊賓對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用［J］.高等學校化學學報，2008，29(4):714-719.

［4］黃 欣，龔益飛，虞 科，等.基于氣相色譜-質譜的代謝組學方法研究四氯化碳致小鼠急性肝損傷［J］.分析化學，2007，35(12):1736-1740.

［5］吳 濤，蔣 嵐，孫玉華.護肝布祖熱顆粒提取新工藝及其對小鼠肝損傷保護作用的研究［J］.中國中藥雜志，2011，36(4):429-433.

［6］Dettmer K，Aronov P A，Hammock B D.Mass spectrometrybased metabolomics［J］.Mass Spectrom Rev，2007，26(1):51-78.

［7］齊艷萍，李和平.急性肝損傷動物模型制備的概述［J］.甘肅畜牧獸醫，2008，38(2):37-39.

［8］黃 欣.基于GC-MS代謝組學的肝臟毒理研究及數據處理方法［D］.杭州:浙江大學，2008.

［9］龔益飛.肝損小鼠代謝組的GC-MS分析方法研究［D］.杭州:浙江大學，2007.

［10］林景超.化學性肝損傷及肝癌的代謝組學研究［D］.上海:上海交通大學，2008.

［11］胡迎青，顧君一.小鼠CCl4急性肝損傷體內氨基酸水平的改變［J］.南通醫學院學報，1995，15(3):372-374.

［12］陳賢明，尹 鐳，許瑞令，等.暴發性肝損傷肝性腦病大鼠血漿及腦游離氨基酸變化的相關分析［J］.中國病理生理雜志，1993，9(3):24-27.

［13］薛文新.基于代謝組學的當歸及其不同炮制品多糖對肝損傷保護作用的研究［D］.蘭州:甘肅農業大學，2012.

［14］Fancy S A，Beckonert O，Darbon G，et al.Gas chromatography/flame ionisation detection mass spectrometry for the detection of endogenous urine metabolites for metabonomic studies and its use as a complementary tool to nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.Rapid Commun Mass Sp，2006，20(15):2271-2280.

［15］Singh H K，Yachha S K，Saxena R，et al.A new dimension of1H-NMR spectroscopy in assessment of liver graft dysfunction［J］.Nmr Biomed，2003，16(4):185-188.