擠出滾圓法制備山楂葉總黃酮微丸

黃竹珺，蒲雪兵，周 英，3，林 冰，王慧娟*

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025;2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽 550025;3.貴州省中藥材繁殖與種植工程實驗室，貴州貴陽 550025)

山楂葉總黃酮是山楂葉提取物中的主要活性成分，主要含有槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷、葒草素等黃酮類化合物［1-2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)這些黃酮類成分可治療心血管疾病，有降壓、增加冠脈血流量、降血脂、耐缺氧、強(qiáng)心、抗心律失常等作用［3-6］。

微丸屬于多單元型給藥系統(tǒng)，與其他一單元型給藥系統(tǒng)相比，具有生物利用度高、不受胃排空因素的影響、血藥濃度平穩(wěn)等不可比擬的優(yōu)點［7-8］。擠出滾圓法是當(dāng)今國際上應(yīng)用較為廣泛的一種制丸方法［9］，具有產(chǎn)品收率高、微丸大小均勻、圓整度好、易于進(jìn)一步包衣等優(yōu)點［10］，但其成型受到物料性質(zhì)和工藝條件的影響［11-12］。本研究以山楂葉提取物為原料，采用擠出滾圓法制備微丸，對微丸的處方和制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以使藥物能夠充分發(fā)揮藥效。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-1801紫外-可見分光光度計 (北京北分瑞利分析儀器 (集團(tuán))有限責(zé)任公司);FA1004電子天平(上海天平儀器廠);GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博達(dá)實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);ZKT-7F真空脫氣儀 (天津市天大天發(fā)科技有限公司);JBZ-300型多功能微丸包衣造粒機(jī) (遼寧醫(yī)聯(lián)新藥技術(shù)研究所);RCZ-6B3型藥物溶出儀 (上海黃海藥檢儀器有限公司);SZ-93A自動雙重純水蒸餾器 (上海亞榮生化儀器廠);PTGS4粉末性能測試儀 (PHARMA TEST);國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩。

1.2 材料 山楂葉提取物 (山楂葉總黃酮純度≥90%，臨沂愛康藥業(yè)有限公司);蘆丁對照品 (純度≥98%，中國固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心);無水乙醇 (AR級，成都金山化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉 (AR級，重慶川江化學(xué)試劑廠);亞硝酸鈉 (AR級，南昌華鑫化學(xué)試劑有限公司);硝酸鋁 (AR級，廣東汕頭市西隴化工廠);乳糖 (上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司);微晶纖維素 (常熟市藥用輔料有限公司);可溶性淀粉 (天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);十二烷基硫酸鈉 (SDS，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);羥丙基-β-環(huán)糊精 (山東新大精細(xì)化工有限公司);雙蒸水 (自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分體外溶出度測定方法的建立

2.1.1 測定波長的選擇 取適量空白輔料、山楂葉提取物和山楂葉總黃酮微丸，按照溶出度實驗方法，取60 min溶出液，經(jīng)顯色后分別在400～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，山楂葉提取物和山楂葉總黃酮微丸溶出液在500 nm處均有最大吸收，而空白輔料此處無吸收，因此選擇500 nm作為測定波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定12.5 mg經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對照品，置50 mL量瓶中，加適量95%乙醇，超聲處理 (功率300 W，頻率50 Hz)45 min使之溶解，放冷，用95%乙醇定容至刻度，搖勻備用。精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加蒸餾水至7 mL，加5%亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1.0 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉10.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，在500 nm波長處測定吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0115x－0.0147(r2=0.9995)。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液4.0 mL，置25 mL量瓶中，按照“2.1.2”項下方法顯色后，在500 nm波長處連續(xù)測定吸光度6次。結(jié)果吸光度RSD值為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液4.0 mL，置25 mL量瓶中，按照“2.1.2”項下方法顯色后，在500 nm波長處每隔10 min測1次吸光度。結(jié)果吸光度 RSD值為1.47%，表明溶液顯色后在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率試驗 取山楂葉總黃酮微丸，研細(xì)，精密稱取6份樣品，置于25 mL量瓶中，分別加入蘆丁對照品15 mg，以蒸餾水溶解并稀釋至刻度，按“2.1.2”項下方法測定。計算平均回收率為99.70%，RSD值為0.46%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.6 微丸的體外溶出度測定方法 按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩC溶出度測定法中第二法操作［13］。以900 mL脫氣蒸餾水為溶出介質(zhì)，溫度為 (37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，取自制的山楂葉總黃酮微丸，分別投入6個溶出杯內(nèi)，在第5、10、15、30、45、60 min時分別進(jìn)行取樣，每次取10 mL溶出液 (同時補(bǔ)液10 mL)，以0.45 μm的微孔濾膜過濾后精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，按照“2.1.2”項下方法，自“加水至7 mL”起依法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求算溶出度，并計算各個時間點的累積溶出度值。

2.2 山楂葉總黃酮微丸的制備 分別稱取山楂葉提取物和微晶纖維素 (MCC)等原、輔料，過100目篩，混勻，加入適當(dāng)潤濕劑制成軟材。經(jīng)擠出機(jī)篩板 (孔徑1 mm)擠成光滑致密的條狀物，置于滾圓機(jī)中，直至顆粒滾制成丸。取出微丸，適度干燥，篩分，以24～50目的微丸進(jìn)行分析和評價。

2.3 休止角的測定 休止角 (α)反映了微丸的流動性，同時也反映其圓整度。按照粉末性能測定儀的操作方法，稱取大于100 g的微丸，固定攪拌槳的高度，轉(zhuǎn)速設(shè)定為20 r/min，微丸傾倒入漏斗中進(jìn)行試驗，并記錄結(jié)果。所測微丸的休止角小于30°，說明流動性較好，圓整度較好。

2.4 處方單因素考察

2.4.1 潤濕劑的選擇 稱取25%山楂葉提取物，微晶纖維素 (MCC)為微丸成型的輔料補(bǔ)足100%，混合均勻，分別以蒸餾水、55%、65%、75%、85%、95%乙醇作潤濕劑，制備微丸。按微丸的成型情況，篩選出合適的潤濕劑，見表2。結(jié)果表明，以65%乙醇作為潤濕劑時微丸的成型較好，故選取65%乙醇作為潤濕劑。

表2 潤濕劑篩選結(jié)果

2.4.2 載藥量的考察 以65%乙醇作為潤濕劑制備微丸，進(jìn)行微丸載藥量的考察。通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，載藥量在很大程度上影響微丸的成型及其質(zhì)量，當(dāng)載藥量小于20%時，微丸圓整度好，得率高;當(dāng)載藥量大于30%時，微丸成球性能差，粒度不均。綜合考慮其臨床使用劑量和微丸的圓整度，將載藥量定為25%。

2.4.3 微丸的體外溶出度考察 制備載藥量為25%山楂葉總黃酮微丸。按照“2.1.2”項下方法，測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求算溶出度，并計算各個時間點的累積溶出度，見圖1。結(jié)果表明，60 min時，微丸的累積溶出度僅達(dá)到73%左右，說明所研制的微丸體外溶出效果不好，需要對處方進(jìn)行優(yōu)化，增強(qiáng)微丸的溶出效果。

圖1 25%含藥微丸的累積溶出度

2.4.4 水溶性輔料對溶出效率的影響及用量選擇 分別選用10%乳糖、10%甘露醇、10%羥丙基-β-環(huán)糊精作為水溶性輔料，加入上述處方中制備載藥量為25%山楂葉總黃酮微丸，測定各個時間點的累積溶出度。結(jié)果表明，水溶性輔料的加入可以不同程度地增加指標(biāo)成分的溶出度，其影響程度:乳糖＞羥丙基β-環(huán)糊精＞甘露醇。結(jié)果表明，乳糖作為水溶性輔料時，微丸的成型較好，60 min時微丸的累積溶出度達(dá)到93%，溶出效果較好，故選擇乳糖作為水溶性輔料，見圖2。隨乳糖用量增加，指標(biāo)成分的累積溶出度增加，結(jié)果見圖3。當(dāng)乳糖的用量超過15%后，微丸成型不理想，故將乳糖的用量定為15%。

圖2 加入水溶性輔料微丸的累積溶出度

圖3 乳糖不同用量微丸的累積溶出度

2.4.5 SDS的加入及用量選擇 在上述處方中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的SDS。制備載藥量為25%的山楂葉總黃酮微丸，測定各個時間點的累積溶出度，結(jié)果見圖4。表明隨SDS用量增加，微丸的溶出效率增加。1%SDS在60 min時的累積溶出度可達(dá)到100%左右，故將其用量定為1%。

圖4 SDS不同用量微丸的累積溶出度

2.5 制備工藝的優(yōu)化 通過多次預(yù)試驗，確定影響擠出滾圓工藝的3個主要因素分別為:擠出頻率 (A)、滾圓頻率(B)和滾圓時間 (C)。本研究選用L9(34)正交表，因素、水平見表3。以60 min的累積溶出度為評價指標(biāo)，對微丸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗因素水平

表4 正交試驗結(jié)果分析

由表4的分析結(jié)果可看出:三因素對成丸影響的大小順序為B＞A＞C，從正交結(jié)果看，最優(yōu)組合為A1B3C1，即擠出頻率為30 Hz，滾圓頻率為40 Hz，滾圓時間為6 min。

2.6 微丸的質(zhì)量評價 按優(yōu)化的處方和最佳工藝制備3批載藥量均為25%的微丸，結(jié)果平均收率達(dá)71.97%。對3批樣品的休止角、脆碎度進(jìn)行測定，平均值分別為26.73°和0.05%。照“2.1.6”項下方法對3批樣品的溶出度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。

結(jié)果表明，優(yōu)化所得工藝制備的微丸圓整度好，大小均勻，硬度適宜，且收率較高。微丸中山楂葉總黃酮在60 min的累積溶出度均達(dá)95%以上，可直接裝入膠囊應(yīng)用，亦可進(jìn)一步通過包衣制備其緩釋微丸。

圖5 3批微丸的累積溶出度

3 討論

軟材制備的好壞直接影響軟材的擠出以及微丸成型，合格的軟材應(yīng)該具備以下特點:濕度、黏度適宜，有一定的塑性，軟材擠出后滾圓過程中呈現(xiàn)出小圓球狀 (即起模)并處于分散態(tài)，小圓球表面光亮圓整，處于未滲出水分和滲出水分的臨界處。

滾圓頻率在微丸制備中起著關(guān)鍵作用，這是由于當(dāng)滾圓頻率較低時，剪切力不夠，不能將擠出的條狀物完全打斷，達(dá)到在滾動中將微丸滾圓并修整成均一的圓球的目的［14］。當(dāng)滾圓頻率較大時，會產(chǎn)生細(xì)粉，降低收率。因此，選用適宜的滾圓頻率進(jìn)行微丸的制備。

本實驗在進(jìn)行山楂葉總黃酮微丸的體外溶出度研究過程中，比較了《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩC溶出度測定法中第一法 (轉(zhuǎn)籃法)與第二法 (槳法)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)籃法操作過程中，膠囊殼溶解后微丸易漂浮在轉(zhuǎn)籃的上部，影響溶出效果，造成實驗誤差。而采用槳法時，可避免此種現(xiàn)象的發(fā)生，降低實驗誤差。因此，本研究選擇槳法進(jìn)行微丸的體外溶出度測定。

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