炒炭對(duì)地榆中鞣質(zhì)量及止血效果的影響

俞 浩，毛斌斌，劉漢珍

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽蚌埠 233100)

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長(zhǎng)葉地榆 Sanguisorba of ficinalis L.var.Longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效，主要用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火燙傷、癰腫瘡毒等證［1］。研究表明，地榆具有抗炎消腫、止血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用［2-5］。地榆供臨床應(yīng)用有生地榆和地榆炭?jī)蓚€(gè)炮制品種，其中生地榆涼血止血，尤以涼血作用較強(qiáng);地榆炭止血、收斂、止痢作用較生地榆顯著增強(qiáng)［1］。當(dāng)前，有關(guān)地榆炮制后鞣質(zhì)含有量變化結(jié)果不一。本實(shí)驗(yàn)以安徽滁州產(chǎn)長(zhǎng)葉地榆為研究對(duì)象，采用《中國(guó)藥典》規(guī)定的炮制方法進(jìn)行炮制，觀察地榆炒炭前后鞣質(zhì)的變化，并觀察炮制對(duì)地榆止血作用的影響，對(duì)地榆炒炭止血合理性進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 藥品與試劑 地榆，采自安徽省鳳陽(yáng)縣韭山，經(jīng)安徽科技學(xué)院劉漢珍副教授鑒定為長(zhǎng)葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根;沒(méi)食子酸(北京儀化通標(biāo)科技有限公司);干酪素 (上海諾泰化工有限公司);亞甲基藍(lán) (天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心);凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間和纖維蛋白原測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備 TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京普析通用儀器公司);TDL-5離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國(guó)華電器有限公司);ACL200全自動(dòng)血凝分析儀 (BECKMANH);體外血栓形成血小板粘附兩用儀 (北京宏潤(rùn)達(dá)科技發(fā)展有限公司);FA21048電子天平 (上海市精密科學(xué)儀器總廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量 (20±2)g，雌雄各半，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為:SCXK(皖)2007-001;SD大鼠，體質(zhì)量 (200±20)g，雌雄各半，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(皖)2011-002號(hào)。

2 方法

2.1 地榆炮制品的制備［6］生地榆:取地榆，洗凈，除去殘莖，潤(rùn)透，切厚片，干燥即得。地榆炭:取凈地榆片，置熱鍋內(nèi)，用武火炒至表面焦黑色，內(nèi)部棕褐色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干，得地榆炭。生地榆和地榆炭打成粗粉備用。

2.2 鞣質(zhì)測(cè)定［6］

2.2.1 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的配制 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，置200 mL棕色量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水至13 mL，用29%Na2CO3溶液稀釋并定容，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)試劑做空白，760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=85.0630X+0.0078，r2=0.9990，在 1 ～10 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 檢測(cè)樣品溶液的制備 精密稱定生地榆或地榆炭粗粉1 g，置250 mL棕色量瓶中，加蒸餾水150 mL，放置過(guò)夜，超聲處理10 min，放冷，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，待測(cè)。

總酚測(cè)定 精密量取檢測(cè)樣品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，余步驟同“2.2.2”項(xiàng)下方法，計(jì)算沒(méi)食子酸的量。

不被吸附多酚測(cè)定 精密稱定干酪素0.6 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入檢測(cè)樣品溶液25 mL，密塞，置30℃恒溫水浴搖床振蕩1 h，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，余步驟同“2.2.2”項(xiàng)下方法，計(jì)算沒(méi)食子酸量。鞣質(zhì)量=總酚量－不被吸附的多酚量。

2.3 地榆炒炭前后吸附力測(cè)定［7-8］

2.3.1 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取烘干至恒定質(zhì)量的亞甲基藍(lán)對(duì)照品40 mg，置500 mL的量瓶中，用pH7的磷酸緩沖液溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的亞甲基藍(lán)對(duì)照品溶液。

2.3.2 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取亞甲基藍(lán)對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，用pH7的磷酸鹽緩沖液定容，搖勻。以相應(yīng)的空白試劑作對(duì)照，670 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，亞甲基藍(lán)質(zhì)量濃度橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.06489X+0.0018，r2=0.9998，在 0.8 ～8.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 吸附力測(cè)定 精密稱取生地榆和地榆炭粉末各0.1 g，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液25 mL，置水浴恒溫振動(dòng)器上振蕩120 min，濾過(guò)，取濾液。以磷酸緩沖溶液為空白對(duì)照，在670 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附量和吸附力。吸附量=加入量－未被吸附量，吸附力=吸附量/樣品量。

2.4 地榆炒炭前后止血凝血作用研究

2.4.1 地榆供試液的制備 稱取生地榆或地榆炭50 g，分別加水500 mL，浸泡 8 h，武火煮沸，文火保持微沸30 min，過(guò)濾，取濾液，濃縮至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL的地榆或地榆炭水提液。試驗(yàn)時(shí)以生理鹽水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

地榆、地榆炭人臨床用量為15 g，按60 kg體質(zhì)量計(jì)，以生藥量折算小鼠的等效劑量為2.25 g/kg體質(zhì)量，大鼠等效劑量為1.75g/kg體質(zhì)量。

2.4.2 地榆炒炭對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響［7］取小鼠60只，隨機(jī)分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.4 g/kg)和空白對(duì)照組。灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，空白對(duì)照組給等容量的生理鹽水。末次給藥后1 h，在距小鼠尾尖1 cm處用剪刀剪斷尾尖，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，并每隔30 s用濾紙擦拭斷尾處1次，至濾紙上無(wú)血跡為止，記錄出血時(shí)間。

2.4.3 地榆炒炭對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響［9-10］取小鼠60只，隨機(jī)分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.4 g/kg)和空白對(duì)照組。灌胃給藥，每日 1次，連續(xù) 7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，空白對(duì)照組給等容量的生理鹽水。末次給藥后1 h，小鼠眶后靜脈叢采血，滴一滴血于潔凈的載玻片上，立即計(jì)時(shí)，并每隔30 s用注射針頭挑動(dòng)1次，至有凝血絲出現(xiàn)時(shí)止，記錄凝血時(shí)間。

2.4.4 地榆炒炭對(duì)大鼠體外血栓形成及凝血參數(shù)的影響［11-12］取大鼠60只，隨機(jī)分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為3.5、1.75 g/kg)，地榆炭高、低劑量組(劑量分別為3.5、1.75 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.3 g/kg)和空白對(duì)照組。灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為5 mL/kg，空白對(duì)照組給等容量的生理鹽水。

2.4.4.1 體外血栓長(zhǎng)度和干、濕質(zhì)量測(cè)定 末次給藥后30 min，戊巴比妥鈉 (劑量為30 mg/kg)麻醉大鼠，仰位固定，腹主動(dòng)脈取血，取2 mL血液注入血栓管，立即將血栓管固定于體外血栓形成血小板粘附兩用儀上，開(kāi)啟儀器，轉(zhuǎn)動(dòng)15 min，取下血栓管，將血栓倒在濾紙上，吸凈血栓表面余血，測(cè)量血栓長(zhǎng)度 (cm)，稱血栓濕重。然后將血栓置64℃烘箱內(nèi)干燥30 min，取出，稱血栓干重。

2.4.4.2 凝血參數(shù)測(cè)定 大鼠腹主動(dòng)脈采血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝 (枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)，取抗凝血，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，采用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間和纖維蛋白原含量。

3 結(jié)果

3.1 地榆炒炭前后鞣質(zhì)的量及吸附力測(cè)定結(jié)果 由表1可知，生地榆鞣質(zhì)含有量為8.92%，吸附力為0.98 mg/g，炒炭后鞣質(zhì)含有量為11.16%，吸附力為1.41 mg/g。說(shuō)明地榆炒炭后鞣質(zhì)量增加，吸附力增強(qiáng)。

表1 地榆炒炭前后鞣質(zhì)及吸附力測(cè)定結(jié)果 (n=5)

3.2 地榆炒炭對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響 由表2可知，生地榆和地榆炭均能顯著縮短小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01);地榆炭高、低劑量組小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間均顯著低于相應(yīng)劑量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01)。說(shuō)明地榆具有很好的止血作用，炒炭后止血作用增強(qiáng)。

表2 地榆炒炭對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響 (x ± s，n=10)

3.3 地榆炒炭對(duì)大鼠體外血栓長(zhǎng)度和干、濕重的影響 由表3可知，生地榆高劑量組和地榆炭高、低劑量組大鼠血栓長(zhǎng)度均顯著高于空白對(duì)照組，差異具有顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強(qiáng)于同等劑量的生地榆 (P＜0.05);生地榆和地榆炭均能顯著增加大鼠血栓濕重和干重，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，地榆炭的作用顯著強(qiáng)于同等劑量的生地榆(P＜0.01)。說(shuō)明生能顯著促進(jìn)大鼠體外血栓的形成，炒炭后促進(jìn)血栓形成作用更強(qiáng)。

表3 地榆炒炭前后對(duì)大鼠體外血栓長(zhǎng)度和干、濕重的影響 (，n=10)

表3 地榆炒炭前后對(duì)大鼠體外血栓長(zhǎng)度和干、濕重的影響 (，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同等劑量的地榆炭比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

/g空白對(duì)照組 —組 別 劑量/(g·kg－1) 血栓長(zhǎng)度/cm 血栓濕重×10－2/g 血栓干重×10－2 2.59±0.37 12.43±1.38 3.38±0.80云南白藥組 0.3 3.58±0.56＊＊ 18.53±2.16＊＊ 4.99±0.54＊＊生地榆高劑量組 3.5 3.08±0.44＊△ 15.90±1.44＊＊△△ 4.06±0.58＊△△生地榆低劑量組 1.75 2.78±0.44△ 15.22±1.70＊＊△△ 3.97±0.37＊△△地榆炭高劑量組 3.5 3.54±0.54＊＊ 18.26±1.10＊＊ 4.86±0.71＊＊地榆炭低劑量組 1.75 3.22±0.43＊＊ 17.73±1.04＊＊ 4.43±0.56＊＊

3.4 地榆炒炭對(duì)大鼠凝血參數(shù)的影響 由表4可知，生地榆和地榆炭均能顯著降低凝血原時(shí)間，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強(qiáng)于同等劑量的生地榆 (P＜0.01);生地榆高劑量和地榆炭高、低劑量均能顯著升高纖維蛋白原含量，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強(qiáng)于同等劑量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01);生地榆和地榆炭均能顯著縮短活化部分凝血酶時(shí)間和凝血酶時(shí)間，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，地榆炭高劑量作用顯著強(qiáng)于生地榆高劑量 (P＜0.05)。說(shuō)明具有促進(jìn)凝血作用，炒炭后凝血作用增強(qiáng)。

表4 地榆炒炭對(duì)大鼠凝血參數(shù)的影響 (，n=10)

表4 地榆炒炭對(duì)大鼠凝血參數(shù)的影響 (，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同等劑量的地榆炭比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

/s空白對(duì)照組 —組 別 劑量/(g·kg－1) 凝血酶原時(shí)間/s 纖維蛋白原/(g·L－1) 活化部分凝血酶時(shí)間/s 凝血酶時(shí)間13.32±1.38 6.86±0.91 27.75±3.96 19.17±1.88云南白藥組 0.3 9.40±0.70＊＊ 10.41±1.12＊＊ 20.13±1.70＊＊ 14.32±2.58＊＊生地榆高劑量組 3.5 11.08±0.52＊＊△△ 7.90±0.90＊△ 23.32±2.33＊＊△ 16.34±1.44＊＊△生地榆低劑量組 1.75 11.48±0.97＊＊△△ 7.23±0.75△△ 24.27±2.29＊＊ 16.59±1.25＊＊地榆炭高劑量組 3.5 9.85±0.73＊＊ 9.12±0.79＊＊ 20.83±2.13＊＊ 14.42±1.95＊＊地榆炭低劑量組 1.75 10.60±0.98＊＊ 8.60±1.65＊＊ 22.09±2.83＊＊ 15.61±1.86＊＊

4 討論

中藥炒炭供臨床應(yīng)用是我國(guó)醫(yī)藥學(xué)的一大特色，炒炭的目的是使藥物增強(qiáng)或產(chǎn)生止血作用，即“炒炭止血”理論。地榆為中醫(yī)臨床常用的止血藥之一，清《本草分經(jīng)》謂“止血炒黑用”［13］。鞣質(zhì)具有收縮創(chuàng)面微血管，并能與創(chuàng)面滲出物中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成大分子，使創(chuàng)傷組織表面蛋白凝固，減少分泌與血漿滲出，并可在血管破損處形成硬塊而發(fā)揮止血作用，由此可見(jiàn)，鞣質(zhì)是中藥止血的主要成分之一。當(dāng)前，關(guān)于地榆炒炭后鞣質(zhì)變化及止血效果的研究報(bào)道較多，但結(jié)果存在較大差異。有研究認(rèn)為，地榆炒炭后鞣質(zhì)含有量下降［14-15］。也有研究結(jié)果顯示，地榆炒炭后鞣質(zhì)含量增加，且能縮短小鼠出血時(shí)間［16-18］。

本實(shí)驗(yàn)采用《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定方法制備了生地榆和地榆炭?jī)蓚€(gè)炮制品種，探討了地榆炮制前后鞣質(zhì)和吸附力的變化，觀察了地榆炮制前后對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響，并觀察了對(duì)大鼠體外血栓形成和凝血參數(shù)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地榆炒炭后與收斂止血功效相關(guān)的成分鞣質(zhì)含有量升高，吸附力增強(qiáng);地榆炭組小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間均顯著低于生地榆組;地榆炭能夠抑制大鼠體外血栓的形成，縮短凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間和活化部分凝血酶時(shí)間，升高纖維蛋白原含量，說(shuō)明地榆炒炭后止血作用增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從地榆炒炭后鞣質(zhì)含有量和止血效果變化揭示了地榆炒炭止血的合理性。有關(guān)地榆炒炭止血的機(jī)制及是否僅與鞣質(zhì)的量的增加有關(guān)有待進(jìn)一步深入研究。

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