貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抗腫瘤作用及急性毒性實驗研究

吳建軍，張延英，張書楠，李金娟，慕婷婷，裴凌云，趙 翊

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

酪蛋白 (casein)是牛奶中的主要組成成分，它是一組蛋白的磷酸鹽，由4種成分組成:αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白［1］。貞芪酪蛋白肽 (ligustri-astragali casein co-peptid，LACP)是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的理論，將黃芪、女貞子按一定比例通過水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成［2］。為探討其對實體瘤生長抑制作用及機(jī)制和安全性，進(jìn)行了本次研究。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞 將Lewis肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×106個/mL的細(xì)胞懸液備用。Lewis肺癌細(xì)胞由蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。

1.2 荷瘤小鼠模型的制作及毒性試驗動物 SPF級8周齡C57小鼠72只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供 (實驗動物合格證號SCXK(甘)2011-0001)。選用培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞按106個/mL制成細(xì)胞懸液，在各組小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL懸液。急性毒性試驗動物SPF級小鼠由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗中心提供，昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，實驗前禁食不禁水喂養(yǎng)12 h，室溫18～22℃，相對濕度50%～70%。

1.3 藥品及試劑 貞芪酪蛋白為以黃芪、女貞子按一定比例按水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成，酪蛋白由蘭州同健生物醫(yī)藥公司提供，批號090211。小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品，胰蛋白酶由美國Gibco公司產(chǎn)品，Iα抗體購自美國Sigma公司，其他試劑采用國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 LACP復(fù)合物體內(nèi)抗腫瘤研究的分組及處理 將72只小鼠除隨機(jī)抽取12只作為陰性對照組之外，其余小鼠Lewis細(xì)胞接種后24 h隨機(jī)分為5組，分別為模型組，貞芪酪蛋白肽復(fù)合物1.5、2.1、3.5 g/kg 3個劑量組，陽性藥物采用金復(fù)康口服液 (江中集團(tuán)一村制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號101208);每日2次，連續(xù)灌胃給藥后第11天麻醉小鼠脫頸處死。生理鹽水進(jìn)行腹腔灌洗，輕柔腹腔2 min后，解剖小鼠抽取灌洗液稀釋細(xì)胞，單核細(xì)胞分離液分離的單核細(xì)胞，調(diào)整密度至106個/mL，以FITC標(biāo)記的Iα單抗 (Sigma公司)標(biāo)記細(xì)胞，洗滌后流式細(xì)胞儀檢測單核細(xì)胞Iα分子表達(dá)活性 (以陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例表示)。另外，取不同劑量組給藥的小鼠右腋窩皮下新鮮腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液于試管中。靜止10 min，吸取上層混濁液。上層混濁液2000 r/min離心5 min，倒去上清。PBS洗滌，制成單細(xì)胞懸液，PI染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2.2 急性毒性及最大耐受量的測定

2.2.1 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測定 取SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表分為4組 (空白組和不同給藥劑量的受試藥物組)，每組15只。給藥劑量為2.0、1.0和0.5 g/kg。按0.20 mL/10 g分別對各受試藥物組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。24 h內(nèi)給藥3次，觀察記錄小鼠毛色、自主活動、呼吸、飲食、大小便等一般情況、中毒表現(xiàn)及死亡情況，共14 d。

2.2.2 LACP復(fù)合物最大耐受量 (MTD)的測定 取SPF級昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組 (空白組和受試藥物組)，每組20只。受試藥物最大質(zhì)量濃度200 mg/mL貞芪酪蛋白按0.4 mL/10 g灌胃給藥，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。

3 實驗結(jié)果

3.1 LACP復(fù)合物對實體瘤細(xì)胞周期的影響 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物作用肺癌實體瘤細(xì)胞，高、中劑量組可見G1期細(xì)胞明顯增多，分別達(dá)到78.1%和64.4%，G2期細(xì)胞減少為4.77%和0.439%，S期分別為17.1%和35.1%，提示細(xì)胞發(fā)生明顯的G1/G2期阻滯。見圖1。

圖1 芪酪蛋白多肽復(fù)合物對實體瘤細(xì)胞周期的影響

3.2 LACP復(fù)合物對免疫細(xì)胞Mφ表面Iα抗原表達(dá)的影響

貞芪酪蛋白肽復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠Mφ細(xì)胞系統(tǒng)類Iα抗原表達(dá)，顯示貞芪酪蛋白肽復(fù)合物可以提高小鼠免疫功能，見表1。

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽性率的影響 (，n=10)

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽性率的影響 (，n=10)

注:與模型組比較，▲P＜005，▲▲P＜001

組別 劑量/(g·kg －1)Iα抗原表達(dá)的陽性率/%36.7±4.1模型組 生理鹽水 37.2±3.9金福康口服液組 0.1 mL/g 49.9±3.9▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽低劑量組 1.5 39.1±3.6貞芪酪蛋白復(fù)合肽中劑量組 2.1 50.3±4.2▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽高劑量組 3.5 56.0±4.5陰性對照組 生理鹽水▲

3.3 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察7 d，記錄動物死亡、體質(zhì)量變化和毒性反應(yīng)情況，結(jié)果無一只動物死亡，因受試藥物濃度和體積限制，無法測出受試藥物的LD50(見表2)，故進(jìn)行MTD測定。

表2 急性毒性試驗結(jié)果 (n=15)

3.4 LACP復(fù)合物MTD測定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察10 d，初步測得MTD值為8 g/kg，記錄小鼠中毒癥狀和死亡情況。觀察結(jié)果為小鼠活動自如，皮毛整潔、有光澤，鼻、眼、口腔未見異常分泌物，進(jìn)食、排泄物及呼吸狀況等均正常，受試動物無一只死亡。第10天處死全部小鼠，解剖并觀察各鼠主要臟器 (心、肝、脾、肺、腎)，未見任何異常改變。小鼠體質(zhì)量變化觀察結(jié)果顯示，與對照組比較，受試藥物組小鼠體質(zhì)量增加無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 MTD測定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (，n=20)

表3 MTD測定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (，n=20)

注:所有組不同時間與空白組比較，P＞0.05

給藥后體質(zhì)量1 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d 10 d空白組 0.4mL/10g 19.2±1.919.8±2.118.5±1.720.1±2.221.5±2.623.2±2.623.8±2.524.8±3.125.6±組別 劑量 開始體質(zhì)量2.7 28.2±3.2受試組 100 mg/mL 19.8±1.720.5±1.919.2±1.921.4±2.122.5±2.623.9±2.624.1±2.725.6±2.928.2±3.2 29.0±3.9

4 討論

貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抑制實體瘤生長作用在前期的研究中已經(jīng)作了論述，其灌胃給藥可有效抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長，其抗腫瘤作用機(jī)制可能與改善荷瘤鼠免疫功能等有關(guān)［3］。多數(shù)蛋白質(zhì)都存在具有生物活性的多肽序列，酶解蛋白質(zhì)可以釋放生物活性多肽［4］。牛乳中酪蛋白中蘊(yùn)藏著許多生物活性肽，包括阿片活性肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗血栓肽、結(jié)合礦物元素的活性肽、抗菌肽等［5-8］。隨著活性肽的研究深入和酶工程技術(shù)應(yīng)用，促進(jìn)了人們對活性肽物質(zhì)的興趣，推進(jìn)了多肽產(chǎn)品如肽類藥物、肽類試劑、化妝品等開發(fā)研究［9-12］。目前，日本以及歐美等國家已上市的大量的活性肽功能性食品或食品添加劑，主要用于調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)康復(fù)，預(yù)防疾病發(fā)生等。酪蛋白復(fù)合多肽同傳統(tǒng)中藥嫁接將極大地豐富完善各自藥理作用，前期課題組的研究進(jìn)一步證實了上述結(jié)論［3，13-15］，本研究根據(jù)“扶正培本、祛邪”理論將黃芪、女貞子與酪蛋白按一定比例配制而成并探索了其抗腫瘤作用及機(jī)制。非已抗原 (如細(xì)菌等)以非特異性方式與巨噬細(xì)胞結(jié)合，后者借助吞噬、胞飲、吸附或FcR、CR介導(dǎo)的調(diào)理作用攝取抗原。巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能與細(xì)胞表面的細(xì)胞因子Iα等表達(dá)密切相關(guān)，所以巨噬細(xì)胞表面Iα的表達(dá)被認(rèn)為是代表機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志之一。本研究應(yīng)用FITC標(biāo)記的Iα單抗借助流式細(xì)胞儀檢測顯示LACP能提高巨噬細(xì)胞表面Iα抗原表達(dá)，可能進(jìn)一步揭示LACP抗腫瘤與調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能有關(guān)。大多數(shù)抗腫瘤藥物主要作用之一與抑制腫瘤細(xì)胞的生長有關(guān)，阻滯腫瘤細(xì)胞從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，本研究顯示LACP阻滯腫瘤細(xì)胞于G1/G2期。

本實驗未測出貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的LD50表明貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的毒性極低;小鼠灌胃給藥的MTD為8g/kg(相當(dāng)于臨床成人擬用藥量300倍)，在該劑量下未見小鼠發(fā)生任何毒性反應(yīng)，處死小鼠解剖后觀察其主要臟器未見任何異常，顯示了LACP復(fù)合物的低毒和安全性，為LACP保健品開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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