突變特異性抗體檢測肺腺癌EGFR基因突變的臨床應用

董丹丹，徐 鋼，李芳華，胥 穎，李 科，黃 娟

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院病理科，四川 成都 610072;2.瀘州醫學院病理學教研室，四川 瀘州 646000)

非小細胞肺癌表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因變異最主要的兩種形式是19號外顯子的缺失(E746-A750，15-bp缺失)和21號外顯子858號密碼子發生的點突變(L858R)［1］，占到肺腺癌患者 EGFR 基因變異的90%以上。EGFR基因狀態的評估，與肺癌患者治療方案的選擇直接相關［2］。其最主要的檢測方法是直接測序法和PCR法［3］，但是這些方法復雜、對實驗室要求高、價格昂貴，在基層醫院推廣應用較難，讓部分患者失去有效治療的機會。由于胸水中的脫落腫瘤細胞、細針穿刺組織、轉移部位的樣本是多數肺癌患者診斷治療及特殊檢測的僅存樣本來源，而肺癌骨轉移的患者，由于骨組織經過脫鈣處理，造成DNA斷裂，會影響后續基因檢測結果，目前已有特異性單克隆抗體可用于標記EGFR基因突變蛋白。如果用免疫組織化學方法檢測EGFR基因突變蛋白的結果具有可靠性，將為上述患者的基因檢測提供更多的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2010～2013年四川省人民醫院病理科76例病理診斷為肺腺癌的標本，其中男45例(59%)，女31例(41%);年齡≤65歲的患者50例(66%)，年齡＞65歲的患者6例(34%);53例患者無吸煙史(70%)，23例患者目前或以往吸煙(30%)。其中外科手術標本35例，支氣管鏡活檢標本39例，胸水脫落細胞標本2例。標本來源包括肺(59例)、淋巴結(5例)、軟組織及腦組織(6例)、胸水(2例)及骨組織(4例)。

1.2 ARMS法檢測EGFR基因突變 5 μm厚的石蠟包埋組織切片3～8張，置于1.5 ml的EP管內。采用QIAGEN公司DNA抽提試劑盒，提取樣本DNA，操作按說明書進行。DNA質量評估及濃度調整:用分光光度計(3100 pro型，Amersham Biosciences)檢測樣本260 nm與280 nm波長吸光度值，以評價其純度及含量。每例樣本所提DNA均符合OD260/OD280在1.8～2.0，用雙蒸水調整DNA濃度至 1.5～3 ng/μl。采用廈門艾德 ADx-ARMSTMEGFR基因突變檢測試劑盒，檢測18～21號外顯子共21個突變位點。反應體系在ABI 7500實時定量PCR儀中進行擴增及數據采集。

1.3 EGFR基因突變特異性抗體進行免疫組織化學標記 石蠟組織塊切片4 μm厚，切片脫蠟沖洗后，采用PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液微波修復15分鐘，3%的H2O2阻斷組織內源性過氧化物酶15分鐘。將切片置入Harris蘇木素染液復染，自來水洗5分鐘，組織切片浸入0.25%氨水中返藍，磷酸鹽緩沖液沖洗后，分別滴加特異性一抗，兩種兔單克隆抗體分別特異性識別人類EGFR基因19號外顯子E746-A750缺失(克隆號 6B6;Cell Signaling Technology，Danvers，MA)和21號外顯子 L858R 點突變(克隆號43B2;Cell Signaling Technology)。一抗采用抗體稀釋液進行稀釋(稀釋倍數1∶150)，4℃冰箱孵育過夜。緩沖液沖洗3次，滴加二抗(Dako REALTMEnvisionTMDetection System，Peroxidase/DAB+，Rabbit/Mouse，Code K5007)，置于濕盒中，37 ℃孵育30分鐘，磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加新鮮配制的DAB顯色劑，室溫顯色5～10分鐘，顯微鏡下控制顯色時間，自來水充分清洗，梯度酒精脫水后封片液封片。

1.4 免疫組織化學結果評分［4］0分:無著色或 ＜10%腫瘤細胞有弱的胞質和/或胞膜著色;1分:＞10%腫瘤細胞具有弱的胞質和/或胞膜著色;2分:＞10%腫瘤細胞具有中度胞質和/或胞膜著色;3分:＞10%腫瘤細胞具有具有強的胞質和/或胞膜著色。

1.5 ARMS法結果判定 試劑盒采用8聯PCR管設計，每一個8聯PCR管檢測一個樣品，1～7號管內裝有相應EGFR基因突變檢測和內控試劑，突變探針由FAM信號指示，內控由HEX信號指示。內控作為對試劑、DNA質量及操作本身的質控，選擇人類EGFR基因相對保守區段。待測樣本的內控HEX信號升起，同時樣本反應管中若有FAM信號升起，則判定相應的EGFR基因突變為陽性。

2 結果

2.1 ARMS法檢測EGFR基因突變 采用ARMS法檢測EGFR基因狀態作為標準對照，本組76例原發或繼發肺腺癌石蠟組織標本，檢出EGFR基因突變28例，其中L858R突變14例，19外顯子缺失病例14例，L861Q突變1例，野生型47例，見圖1。

2.2 免疫組化法測EGFR基因突變

2.2.1 EGFR-L858R突變檢測結果 采用EGFRL858R特異性抗體進行免疫組織化學標記，陽性檢出率為14%，敏感性79%，特異性92%，準確性92%，陽性預測值69%，陰性預測值95%。若陽性閾值定為2+，沒有假陽性病例，敏感性為57%，見圖2。

2.2.2 EGFR基因19號外顯子突變檢測結果 采用EGFR基因19號外顯子15bp E746-A750缺失特異性抗體進行免疫組織化學標記，陽性檢出率為14%，敏感性79%，特異性79%，準確性79%，陽性預測值46%，陰性預測值94%。若陽性閾值定為2+，出現1例假陽性病例，敏感性為50%，見圖3。

2.3 ARMS法與IHC法對比 根據臨床醫生需要提供所有的突變結果，將EGFR-L858R突變和19號外顯子15bp E746-A750缺失特異性抗體免疫組織化學標記的結果綜合判斷，其陽性檢出率為37%，敏感性79%，特異性79%，準確性79%，陽性預測值55%，陰性預測值95%，見表1、表2。

本組研究共4例肺腺癌骨轉移標本，通過抗體進行免疫標記，結果檢測4例中有1例存在21號外顯子的L858R突變，其余3例為陰性病例，與AMRS法的檢測結果一致。胸水脫落細胞標本突變檢測兩種方法均為陰性。

3 討論

據文獻報道亞洲人群肺腺癌患者EGFR基因突變率約為40%［5］。對肺腺癌患者進行個體化的治療依賴于臨床對患者基因狀態進行檢測評估［6］。本組ARMS法檢測結果顯示EGFR基因19、21外顯子總體突變率為37%，與文獻報道結果相似。然而，分子生物學方法檢測基因狀態價格昂貴、結果判斷復雜、標本要求較高，不能夠在所有醫院推廣應用。對于腫瘤組織過少的穿刺活檢樣本，若不能滿足200個腫瘤細胞以上的要求，分子水平檢測的敏感度無法達到識別其是否存在突變。免疫組織化學檢測對腫瘤細胞數量沒有特別要求，且能定位，目前已能在大多數病理實驗室開展，價格經濟，結果判讀易于掌握，若適合在臨床推廣應用將是分子檢測的有效補充。

Tsai等［7］采用單克隆抗體免疫組織化學方法檢測78例肺腺癌石蠟組織樣本EGFR基因21外顯子L858R突變和19外顯子 E746-A750缺失，檢測敏感性分別為78%、88%，特異性分別為86%、96%。本組實驗采用EGFR基因21外顯子L858R突變抗體檢測76例非小細胞肺癌，其敏感性為79%(11/14)，特異性92%(57/62)，陰性預測值達95%(57/60);EGFR基因19外顯子 E746-A750缺失蛋白抗體，檢測敏感性為79%(11/14)，特異性79%(49/62)，陰性預測值達94%(49/52)。L858R突變特異性蛋白檢測敏感性和特異性稍高于Tsai等［7］的實驗結果，19外顯子E746-A750缺失蛋白檢測的敏感性和特異性則低于其結果。EGFR基因19外顯子E746-A750缺失蛋白抗體不能檢測15 bp以外的缺失，這是導致免疫組織化學檢測敏感性低于ARMS法的原因之一。

圖1 ARMS法檢測EGFR基因 a:19外顯子缺失陽性，樣本S形曲線升起;b:21外顯子L858R突變陽性，樣本S形曲線升起

圖2 L858R突變抗體免疫組織化學染色 a:弱陽性(×100);b:中度陽性(×100);c:強陽性(×100)

圖3 E746-A750 15 bp缺失抗體免疫組織化學染色 a:弱陽性(×100);b:中度陽性(×100);c:強陽性(×100)

表1 EGFR突變特異性抗體免疫組織化學標記(IHC)與ARMS法檢測結果關系

表2 EGFR突變特異性抗體免疫組織化學標記結果評價(%)

有作者提出評估免疫標記結果陽性細胞數及染色強度可能會提高結果的敏感性［8］。本組實驗的結果顯示，若將陽性閾值定為1+，L858R突變抗體、19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢測的敏感性均為79%，較陽性閾值定為2+，兩種抗體檢測的敏感性(57%、50%)有明顯提高。然而閾值定為1+，假陽性病例隨之出現。本組實驗中，8例免疫組織化學L858R突變抗體檢測結果為1+的病例，ARMS法檢測5例為陰性，僅3為突變陽性病例，免疫標記出現的假陽性病例占到了63%。19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢測結果為1+的病例共16例，12例ARMS法檢測為陰性，僅4為陽性，免疫標記出現的假陽性病例占到了75%。但若將陽性閾值定為2+，L858R突變抗體檢出8例陽性病例，無一例假陽性。而19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢出8例陽性病例，其中一例免疫標記結果3+的病例ARMS法檢測結果為突變陰性。可見將免疫標記的陽性閾值定為2+，檢測具有較高特異性(94%，15/16)，然而仍存在6%的假陽性率。

本組實驗L858R突變抗體、19號外顯子缺失抗體免疫標記結果為0的病例，通過ARMS法驗證，假陰性病例分別為5%(3/60)、6%(3/52)，其陰性預測值分別達到95%和94%。可見兩種特異性抗體對突變陰性病例檢出的準確性較高，如果用兩種特異性抗體進行免疫標記篩選臨床突變陰性患者會收到令人滿意的結果。對于無法開展分子水平檢測的醫院，若采用免疫組織化學法篩查EGFR基因突變蛋白，檢測結果為陰性的患者，不宜采用分子靶向藥物治療;突變蛋白檢測為2+及以上的病例，有條件可進一步做分子生物學檢測確診;對于免疫組織化學檢測為1+的病例，必須做分子生物學檢測進一步明確基因狀態。本組研究中4例肺腺癌骨轉移標本，免疫標記檢出1例具有21號外顯子的L858R突變，其余3例為突變陰性病例，與AMRS法檢測的結果一致。說明免疫組織化學方法能有效檢測骨組織這類經過脫鈣處理的樣本。分子水平的檢測方法一般過程較繁瑣、耗時長、實驗室要求高，而免疫組織化學方法則相對簡單、時間短、對實驗室沒有特殊要求。

本組研究顯示免疫組織化學方法篩查EGFR特異性突變蛋白的陰性預測值高，僅能檢測已知突變蛋白，對于L861Q、T790M等具有臨床治療指導價值的突變則不能測定，該方法檢測的敏感性和特異性并不十分令人滿意，如何提高該方法的敏感性和特異性值得更深入的探討。

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