p16、p53和Ki67在宮頸癌中的表達及其臨床意義

雷 蕾，葉 斌，王西川

(成都市第六人民醫院 a.腫瘤科，b.病理科，四川 成都 610051)

宮頸癌是一種發生在子宮頸上皮的惡性腫瘤，也是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二個最常見惡性腫瘤，其發病率在我國居女性生殖道惡性腫瘤第一位，發病年齡高峰為40～60歲。宮頸癌最常見的組織學類型是鱗狀細胞癌，其發病機制尚不完全清楚，但現有的研究表明宮頸癌的發生、發展是由宮頸鱗狀上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)到浸潤癌的連續發展過程［1］，是多種癌基因和抑癌基因的表達、調控以及細胞凋亡參與的多步驟的復雜過程［2］。p16是一種新型抑癌基因，參與了腫瘤發生發展的周期調控。p53基因是重要的抑瘤基因，分為野生和突變兩種亞型，是細胞增生的主要負調控子，該基因的突變或缺失是導致許多腫瘤發生的原因。Ki67是一種細胞增殖核抗原，其表達與多種腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移有關。本研究采用免疫組化方法檢測宮頸炎和宮頸癌組織中p16、p53蛋白和Ki67表達情況，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院婦產科2007年4月至2013年10月宮頸活檢/錐切及手術標本共92例，其中宮頸癌52例，患者年齡32～85歲，中位年齡55歲;CIN40例，患者年齡30～64歲，中位年齡50歲。同期宮頸炎標本26例用于對照，患者年齡35～78歲，中位年齡50歲。所有標本均經組織病理確診。患者術前均未接受過放化療。宮頸癌患者臨床分期按2009版FIGO分期標準:Ⅰ期14例，ⅡA期8例，ⅡB期6例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。宮頸癌病理分級:G1 10例，G2 10例，G3 32例。周圍淋巴結轉移情況:發生淋巴結轉移者25例，未發生淋巴結轉移者27例。

1.2 檢測方法 采用免疫組化PV-9000法。所有抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。脫蠟、水化組織切片;高壓鍋抗原熱修復;3%H2O2去離子水孵育以阻斷內源性過氧化物酶;滴加一抗，4℃過夜;PBS沖洗，滴加聚合酶輔助劑，37℃孵育20 min;PBS沖洗后滴加辣根酶標記山羊抗小鼠IgG多聚體，37℃孵育30 min;應用DAB溶液顯色;自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.3 結果判斷 于顯微鏡下觀察，每例觀察2張切片，每張切片隨機選擇10個高倍視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，取其平均值為細胞的陽性率。結果判斷:p16陽性定位在細胞核和(或)胞漿;p53和Ki67陽性定位在細胞核。凡是呈現清晰的棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數所占比例＜10%為陰性(-)，比例≥10%為陽性(+)。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計數資料以頻數表示，進行χ2檢驗，多個樣本間的比較采用卡方分割法(調整后P'＜0.016為差異有統計學意義)，相關性分析采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織、CIN與宮頸炎組織中 p16、p53和Ki67的表達 p16、p53蛋白及Ki67在宮頸癌、CIN中、宮頸炎中表達差異有統計學意義(P＜0.05);兩兩比較顯示p16、p53蛋白及Ki67在宮頸癌、CIN組織中的陽性表達率均顯著高于宮頸炎(P＜0.05)，見表1。

表1 宮頸癌組織、CIN組織和宮頸炎組織中p16、p53蛋白及Ki67的表達 ［n(%)］

2.2 宮頸癌組織中p16、p53及Ki67蛋白表達與臨床病理特征的關系 52例宮頸癌中，p16、p53蛋白及Ki67的陽性表達與臨床分期和組織學分化程度有關(P＜0.05);與淋巴結轉移和年齡無相關性(P＞ 0.05)，見表2。

2.3 宮頸癌組織中p16、p53和Ki67蛋白表達之間的關系 52例宮頸癌中，p16和Ki67蛋白同為陽性者21例，同為陰性者10例，p16與Ki67的表達相關(χ2=4.805，P=0.028);p53 和 Ki67 蛋白同為陽性者19例，同為陰性者11例，p53與Ki67的表達相關(χ2=5.983，P=0.014)，見表 3。

表3 P16、P53和Ki67在宮頸癌組織中表達的相關性分析 (例)

3 討論

宮頸癌標志物的檢測可反映腫瘤的生物學特性，對診斷、治療及預后具有重要意義。p16基因又稱MTS1(多腫瘤抑制基因)，為細胞周期依賴性激酶(CDK)抑制蛋白，是1994年6月由Kamb報道的一種新型抑癌基因［3］。p16與細胞周期素D(Cyclin D)競爭CDK4、CDK6，通過抑制它們的活性，使其一系列底物(如Rb)保持持續去磷酸化高活性，而不能解除pRb對轉錄因子E2F等的抑制，最終阻止細胞由G1期進入S期，直接抑制細胞增殖［4］。研究表明，在許多腫瘤中均有p16的突變 、缺失，導致細胞周期調節紊亂，使細胞無限制增生，甚至癌變。孟慶更等［5］發現，p16陽性表達與HPV感染密切相關，且可作為篩查宮頸癌及其癌前病變的重要指標。Carozzi等［6］發現，p16檢查可預測HPV陽性女性發生高級別宮頸上皮內瘤樣病變或更差臨床狀況的風險。本研究結果顯示，p16蛋白在宮頸癌組織的陽性表達率為44.23%，CIN組織中的陽性表達率為35%，均明顯高于宮頸炎組織，結果與郭建華等［7］研究相符。且在本研究中，蛋白p16的陽性表達與宮頸癌的臨床分期和組織學分化程度有關(P＜0.05)，蛋白p16在ⅡB期以上的陽性表達顯著高于Ⅰ期和ⅡA期(P＜0.05)。上述結果提示p16突變與宮頸癌的發生、發展有關，提高檢測可用于高級別CIN和宮頸癌的早期診斷，與宮頸癌臨床分期及病理相結合，可用于判斷預后。

p53蛋白是重要的細胞生長負調節因子，p53基因突變導致對細胞周期的調節功能喪失，使細胞異常增殖和惡性轉化。它與細胞周期蛋白(cyclins)結合形成復合體，抑制依賴細胞周期蛋白的相關激酶(CDKs)活性，使細胞停滯在G1期或引起細胞程序性死亡，從而消除可能癌變的異常細胞［8］。p53基因大約有50%的突變率，當p53基因發生突變時，可導致穩定的蛋白質不能完成抑制細胞增殖的作用，并且促進細胞惡性轉化，使p53基因由抑癌基因轉為原癌基因［9］。由于野生型p53蛋白代謝不穩定，半衰期僅20～30 min，且細胞內含量低，因此，用免疫組化方法不能檢出;突變型p53蛋白半衰期延長(數小時)，細胞核內出現突變型p53蛋白的集聚，因而用免疫組化方法能夠檢出［10］。本研究結果顯示，p53蛋白在宮頸癌和CIN組織中的陽性表達率明顯高于宮頸炎組織。同P16相似，蛋白p53的表達與宮頸癌的臨床分期和組織學分化程度有關(P＜0.05)，與淋巴結轉移及年齡無關(P＞0.05)，與樓朝霞等［11］研究相符。上述結果提示p53突變在CIN到宮頸癌的發生發展中起重要作用，其檢測可作為癌前病變和宮頸癌早期診斷及指導預后的一項重要指標。

Ki67抗原是Gerdes等于1983年發現的在增殖細胞中表達的一種核抗原，也是目前較為肯定的核增殖標志。主要功能與細胞合成代謝有關。除了G0期和G1早期外，其他各期均有此抗原表達，惡性腫瘤中常呈高表達［12］。已有研究顯示，Ki-67抗原與肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部癌、消化道腫瘤等密切相關，可能與這些腫瘤的發生、發展、分級、分期、浸潤和轉移、復發及預后等各方面均有相關性［13］，可作為診斷、預測療效和預后等方面的標志物。本研究中，Ki67抗原在宮頸癌和CIN組織中的陽性表達率明顯高于宮頸炎組織(P＜0.05)，提示在宮頸上皮細胞癌變過程中，細胞增殖活性逐漸增強。Ki67的陽性表達在不同臨床分期和組織分化程度的宮頸癌標本中差異有統計學意義(P＜0.05);而在宮頸癌有無淋巴結轉移和不同年齡，差異無統計學意義(P＞0.05)。提示Ki67對鑒別宮頸癌及宮頸炎有重大的意義，且與宮頸癌的診斷及預后有一定的相關性。有研究提出，有淋巴結轉移者Ki67高于無淋巴結轉移者，本結果似有不同，考慮與臨床檢查診斷有無淋巴結轉移尚存在一定困難有關，有待進一步研究。

綜上所述，宮頸癌中p16、p53及Ki67基因表達上調，與宮頸癌的發生、發展密切相關，將三者作為生物標志物進行聯合檢測，有利于對宮頸癌患者惡性程度及預后的評估。

［1］伍靚，吳奇，李晶.COX-2、VEGF及MVD在宮頸癌中的表達及意義［J］.海南醫學院學報，2014，20(2):172-176.

［2］Sehnal B，Driák D，Neumannová H，et al.Prevalence of anal human papillomavirus infection among women and its relation to cervical HPV infection.Ceska Gynekol.2012;77(3):210-214.

［3］Lee ES，Kim LH，Abdullah WA，et al.Expression and alteration of P16 in diffuse large B cell lymphoma［J］.Pathobiology，2010，77(2)，96-105.

［4］劉微，瞿全新.細胞角蛋白與 p16INK4a在宮頸癌前病變及宮頸癌中的研究進展［J］.國際婦產科學雜志，2012，39(3):262-264.

［5］孟慶更，蔡茹藝.宮頸癌及其癌前病變中HPV感染與P16INK4A蛋白表達的關系［J］.北京醫學，2009，31(7):434-435.

［6］Carozzi F，Gillio-Tos A，Confortini M，et al，Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16-INK4A results:a prospective analysis of a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial［J］.Lancet Oncol，2013，14(2):168-176.

［7］郭建華，伍亞云，劉俊宏，p53、p16和 C-myc基因表達在宮頸癌早期診斷中的價值［J］.現代中西醫結合雜志，2013，22(23):2518-2523.

［8］王喜梅，羅光霞，張雪梅，等.宮頸腺癌HPV18/18感染與ki67、p53 蛋白表達的關系［J］.實用癌癥雜志，2009，24(1):22-25.

［9］于永亮，尚亞非.p53蛋白表達對結腸癌術后腫瘤復發轉移預后的關系［J］.實用醫技雜志，2007，14(36):5014-5015.

［10］蔡仙麗.P53基因在宮頸癌組織中的表達及與細胞質胸苷激酶關系的臨床研究［J］.中華危重癥醫學雜志(電子版)，2013，6(4):236-238.

［11］樓朝霞，梅麗娜.宮頸癌組織中突變型 p53基因的表達及其臨床意義［J］.海南醫學，2013，24(9):1272-1274.

［12］Deng XJ，Wu HG.The expression and its clinical significance of Ki67 and PTEN in ovarian serous tumor［J］.The Practical Journal of Cancer，2011，26(4):365-371.

［13］黃宇，胡曉樺，劉志輝.Ki-67表達與鼻咽癌、乳腺癌化療療效及預后的臨床分析［J］.中華臨床醫師雜志，2013，7(2)641-645.