RP-HPLC法測定人血漿中的萬古霉素濃度

江蘇省泰州市中醫院（225300）王威 王姝梅 朱春健

萬古霉素（Vancomycin）是糖肽類抗生素，抑制細菌細胞壁的合成，臨床上主要用于嚴重的革蘭陽性菌感染，特別是耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(MRSE)所致的感染[1]。但萬古霉素的治療指數窄，個體差異大，影響因素多，且具有一定的耳腎毒性[2]，因此對患者進行萬古霉素的血藥濃度監測尤為重要。

隨著分析儀器與分析方法的不斷發展，萬古霉素血藥濃度的測定方法也由探索轉為規范。有研究報道，熒光偏振免疫法及高效液相色譜法是目前常用的萬古霉素血藥濃度測定方法[3]。本研究采用反相高效液相色譜法測定了萬古霉素的血藥濃度，現匯報如下。

1 資料和方法

1.1 藥品與試劑 萬古霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所），磷酸氫二鉀（分析純），磷酸（分析純），硫酸鋅（分析純），乙腈（色譜純），空白血漿（泰州中醫院輸血科），水為超純水。

1.2 儀器日本島津HPLC儀，LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測器，LC-SOLUTION工作站；離心機（上海安亭科學儀器廠）；旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）。

1.3 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動相：乙腈-0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液（8 ∶ 92，V/V）；檢測波長：236nm；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

1.4 標準溶液的配置 精密稱取萬古霉素標準品12.50mg加超純水溶解并于25mL量瓶中定容，配成質量濃度為500 mg?L-1的標準品儲備液，置冰箱4℃貯存備用。

1.5 流動相的配置 取磷酸二氫鉀1.70g加超純水溶解并于1000mL量瓶中定容，磷酸調pH至3.2，配成0.0125 moL?L-1的磷酸二氫鉀緩沖液；取乙腈460mL，磷酸二氫鉀緩沖液40mL，混合超聲30min。

1.6 10 %硫酸鋅溶液的配置 精密稱取硫酸鋅5.0 g加超純水溶解并于50mL量瓶中定容，配制成10%硫酸鋅溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存備用。

1.7 血樣處理 取200μL空白血漿，加入50μL 10%硫酸鋅，旋渦混勻，12000r?min-1離心4min，取上清液10μL進樣，記錄色譜圖。

2 結果

2.1 專屬性考察 分別取空白血漿100μL、空白血漿100μL加一定量的標準品溶液、病人用藥后血漿100μL，按“1.7”項下方法處理，并按“1.3”項下色譜條件進樣測繪HPLC圖譜，色譜圖見附圖。結果表明，血漿中成分不干擾萬古霉素的測定。

2.2 標準曲線的繪制 取標準品儲備液，用超純水分別稀釋成濃度為5，10，20，40，100，200，400mg?L-1的標準溶液，取空白血漿100μL置于帶塞離心管中，加入不同濃度的標準溶液100μL，混勻，使萬古霉素的濃度分別為2.5，5，10，20，50，100，200mg?L-1。按“1.7”項下方法處理，并按“1.3”項下色譜條件進樣測繪HPLC圖譜，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，以萬古霉素進樣濃度（X，mg?L-1）為橫坐標，采用加權(1/C2)最小二乘法進行回歸計算，得回歸方程Y=9065.1 X - 235.46（r=0.9997， n=7）。結果表明萬古霉素進樣濃度在2.5～200 mg?L-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

附圖 萬古霉素（1）的血漿樣品色譜圖

2.3 精密度測定 分別取空白血漿100μL，加入低、中、高3個濃度的標準溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5 mg?L-1，50 mg?L-1，200 mg?L-1，按血樣處理和測定方法操作，以1天內每個濃度5個樣品測定的萬古霉素濃度計算日內精密度，以一周內連續3天測定的萬古霉素濃度計算日間精密度。結果低、中、高3個濃度日內RSD分別為3.91%，2.38%，1.77%，日間RSD分別為4.01%，2.35%，1.82%。

2.4 回收率試驗 取空白血漿100μL，分別加入低、中、高3個濃度的標準溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5mg?L-1，50mg?L-1，200 mg?L-1，每個濃度各配置5個樣品，按血樣處理和測定方法操作，按標準曲線計算出萬古霉素的濃度，并按照公式計算回收率：回收率（%）=測得值/加入值×100%。結果低、中、高濃度的相對回收率分別為99.4%，100.3%和99.2%，RSD分別為2.9%，3.2%，1.8%（n=5）。

2.5 穩定性考察 取空白血漿100μL，分別加入低、中、高3個濃度的標準溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5 mg?L-1，50 mg?L-1，200 mg?L-1，每個濃度各配置3個樣品，室溫放置，于0、1、2、4、6、8、24h，按血樣處理和測定方法操作，測定萬古霉素的濃度。結果低、中、高濃度的萬古霉素峰面積積分值RSD分別為1.47%，1.57%和1.12%，表明萬古霉素血漿樣品在24h內穩定。

3 討論

本研究分別考察了磷酸二氫鉀溶液-乙腈體系、磷酸二氫鉀溶液-甲醇體系以及磷酸二氫鉀溶液-乙腈-甲醇體系作為流動相時對萬古霉素色譜行為的影響，結果表明，磷酸二氫鉀溶液-甲醇體系下，色譜峰寬大且分離效果不佳；文獻中常用流動相“磷酸二氫鉀溶液-乙腈-甲醇體系”配備復雜，重現性較差；磷酸二氫鉀溶液-乙腈體系下能夠得到較滿意的色譜峰。因此本研究最終采用乙腈-0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液（8∶92，V/V）作為流動相。

通過研究還發現，應用磷酸二氫鉀緩沖體系能夠一定程度低改善峰形，但緩沖液濃度過大時會造成鹽析，導致柱壓升高，從而影響分離效果。本研究考察了0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液pH值分別為4.5、3.6、3.2、3.0時萬古霉素的保留時間及峰形變化。結果表明，當pH為3.2時，峰形對稱，保留時間合適。因此流動相中磷酸二氫鉀緩沖液的pH選擇為3.2。

醫學臨床上，血漿樣品的處理方面較為常用的有直接沉淀法和固相萃取法，這兩種方法在萬古霉素血漿樣品的處理中均有應用[5][6]，本文采用直接沉淀法，以10%硫酸鋅作為沉淀劑，使用劑量少，且處理效果較好，處理后樣品對萬古霉素色譜峰無干擾。