NF-κB及下游炎癥因子在胰島素抵抗大鼠腎臟中的表達

閆雙通，李春霖，陸菊明，田慧，谷昭艷，劉瑜

有研究認為，核轉錄因子(NF-κB)是糖尿病及其慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中的一個重要因素。已經明確，NF-κB與糖尿病的多種并發(fā)癥如糖尿病腎臟病變、糖尿病心肌病變、糖尿病視網膜病變等均存在相關性[1-4]。然而，目前關于NF-κB的活化與胰島素抵抗(IR)相關性的研究并不多，而IR的發(fā)生與代謝異常密切相關，因此是否在IR階段就已存在NF-κB的活化值得探討。本研究通過建立實驗性IR大鼠模型，從蛋白和基因水平探討NF-κB及其下游炎癥因子iNOS和COX-2在IR大鼠腎臟組織損傷發(fā)生發(fā)展中表達的變化及其作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 同一批號SPF級健康雄性2月齡Wistar大鼠30只，體重200～250g，隨機分為正常對照(NC)組(n=15)和IR組(n=15)，分別給予普通飲食和高脂飲食喂養(yǎng)。Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，批號為：SCXK(京)2007-0001。實驗大鼠在解放軍總醫(yī)院動物中心SPF環(huán)境下喂養(yǎng)，自由進食飲水，室內溫度22～24℃，濕度40%～60%，定期紫外線消毒。普通動物飼料及高脂飼料均購于中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)科大學動物所。

1.2 體重及生化指標的檢測 兩組大鼠于飼養(yǎng)期間每10d于固定時間測體重1次并記錄。喂養(yǎng)2個月后禁食12h，將大鼠麻醉后經腹主動脈取空腹血，4℃過夜，1000r/min離心后取上清液測生化指標：空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、膽固醇(Ch)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及游離脂肪酸(FFA)。

1.3 高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗 在大鼠清醒狀態(tài)下以2%利多卡因尾根部局部麻醉，尾靜脈插管，尾動脈末端取血。鉗夾實驗開始10min，以12mU/(kg·min)的速率微量泵入人胰島素溶液(諾和靈40U/ml)，使血糖水平低于空腹水平0.5mmol/L，隨后的110min內以4mU/(kg·min)的速率持續(xù)輸入胰島素。在此期間使用羅氏血糖儀每5min測血糖1次，根據血糖調整葡萄糖液輸注速率(GIR)，使鉗夾血糖接近正常空腹血糖值，即4.4～5.5mol/L，并記錄調整時間。計算60～120min的穩(wěn)態(tài)葡萄糖GIR，以此反映胰島素敏感性；用血糖變異系數(CVBG)反映鉗夾實驗準確性，GIR變異系數(CVGIR)反映鉗夾實驗可靠性。

1.4 樣品采集及制備 所有大鼠在喂養(yǎng)2個月后處死。乙醚快速麻醉后迅速打開腹腔，取出腎臟，用等滲生理鹽水清洗并充分灌洗，濾紙吸干，去腎臟包膜及結締組織。將腎臟組織切割成若干份，置入10%中性甲醛溶液固定2h；梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片10張，切片厚度約4～5μm。同時留取腎臟組織入液氮內保存。

1.5 HE染色觀察腎小球形態(tài)的變化 將經石蠟包埋的腎臟組織切片放入二甲苯中脫蠟→無水乙醇，95%、80%、70%乙醇各5min后放入自來水水化→蘇木素染色后自來水洗→顯微鏡下觀察細胞核著染情況→0.5%鹽酸乙醇分化數秒后，流水沖洗水化→伊紅染色后50%乙醇適當分化→分別經75%、95%、100%乙醇脫水→二甲苯透明5min×2次→中性樹膠封片，鏡下觀察結果。

1.6 免疫組化染色檢測iNOS、COX-2的表達 腎臟組織石蠟包埋后制成切片，將切片進行烤片、乙醇脫水、枸櫞酸鹽煮沸抗原修復3min后H2O2中孵育15min。相應滴加兔多克隆iNOS抗體(1:165稀釋)及兔COX-2抗體(1:70稀釋，Santa Cruz公司)50μl，其后根據一抗類型分別選擇滴加相應辣根過氧化物酶標記的二抗50μl，溫箱內孵育1h左右，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色1～5min。陰性對照用PBS代替一抗。

1.7 RT-PCR檢測大鼠腎臟組織NF-κB、iNOS及COX-2 mRNA的表達 分離部分腎臟組織，提取總RNA后經反轉錄反應得到cDNA溶液。PCR反應體系為cDNA 2μl，2×SYBR Mix(加4mmol/L Mg2+)25μl，目的基因上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.3μl。PCR反應條件：95℃預變性20s，58℃退火25s，72℃延伸30s，共47個循環(huán)。以同樣體系進行看家基因GAPDH熒光定量作為內參照，用2－ΔΔCt值表示基因的相對表達量。

1.8 電泳遷移率變動分析(EMSA)檢測腎臟組織NF-κB蛋白結合力 具體步驟：冰上研磨腎臟組織，加PBS成細胞懸液，離心回收細胞，先后使用細胞裂解液Ⅰ及細胞裂解液Ⅱ、核裂解液處理細胞，其后離心，取上清液于－80℃保存。使用BSA法對各組腎臟組織蛋白進行含量測定。凝膠電泳照相后測定其相應灰度值，對各組大鼠標本所得結果進行分析，灰度值越高則相應組別核蛋白NF-κB結合程度越高，則相應組別的NF-κB激活程度越高。雙鏈寡核酸NF-κB探針序列為：5-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3；3-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用Stata 8.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以s表示，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠體重及生化指標比較 與NC組相比，IR組大鼠體重、心臟重量、腎周和附睪脂肪重量/體重均明顯增加(P＜0.05)，FINS、FFA、HDL-C、Ch、HOMA-IR水平均明顯升高(P＜0.05)，GIR明顯低于NC組(P＜0.05，表1)。

表1 大鼠體重及生化指標結果比較(s，n=15)Tab.1 Comparison of body weight and biochemical results of rats s, n=15)

表1 大鼠體重及生化指標結果比較(s，n=15)Tab.1 Comparison of body weight and biochemical results of rats s, n=15)

FBG. Fasting blood glucose; FINS. Fasting insulin; FFA. Free fatty acid; HDL-C. High-density lipoprotein cholesterol; LDL-C. Lowdensity lipoprotein cholesterol; TG. Triglyceride; Ch. Cholesterol;HOMA-IR. Homeostasis model assessment of insulin resistance; GIR.Glucose infusion rate. (1) P＜0.01 compared with NC group

Item NC group IR group Weight (g) 490.5±7.7 587.2±11.2(1)Heart weight (g) 1.25±0.03 1.56±0.07(1)Heart weight/Body weight (%) 0.25±0.01 0.26±0.01 Liver weight (g) 11.6±0.7 12.1±0.8 Liver weight/Body weight (%) 2.89±0.12 2.75±0.08 Fat weight of the periphery of kidney and prostate 18.0±2.1 21.1±1.8 Fat weight of the periphery of kidney and prostate/Body weight (%) 3.77±0.37 4.27±0.26(1)FBG (mmol/L) 4.76±0.64 4.85±0.35 FINS (mU/L) 14.58±3.13 35.82±7.25(1)FFA(mmol/L) 0.76±0.25 1.01±0.22(1)HDL-C(mmol/L) 0.890±0.006 0.503±0.045(1)LDL-C(mmol/L) 0.155±0.002 0.142±0.024 TG (mmol/L) 0.81±0.02 0.84±0.06 Ch (mmol/L) 0.99±0.11 1.68±0.23(1)HOMA-IR 3.09±0.8 7.72±0.65(1)GIR [mg/(kg·min)]26.02±5.66 18.96±4.76(1)

2.2 腎臟組織HE染色結果 與NC組相比，IR組大鼠腎小球明顯肥大、基質明顯增寬、炎細胞浸潤明顯增多(圖1)。

圖1 大鼠腎臟組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of renal tissue in rats (×200)

2.3 兩組腎臟組織iNOS和COX-2表達情況 免疫組化染色結果顯示，IR組大鼠腎臟組織iNOS和COX-2表達(分別為0.480±0.028、0.532±0.088)與NC組(分別為0.036 ±0.041、0.235±0.028)比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

2.4 腎臟組織NF-κB及iNOS、COX-2 mRNA表達情況 RT-PCR檢測結果顯示，IR組大鼠腎臟組織中NF-κB、iNOS及COX-2 mRNA表達水平與NC組比較均明顯升高(P＜0.05，圖3)。

2.5 EMSA結果 使用生物素標記的NF-κB寡核苷探針，對兩組大鼠腎臟組織的NF-κB核蛋白NF-κB DNA結合力進行比較，結果顯示，IR組大鼠腎臟組織核蛋白NF-κB DNA結合力顯著升高，表明IR組大鼠腎臟組織NF-κB激活程度較高(P＜0.05，圖4)。

圖2 免疫組化檢測大鼠腎臟組織COX-2、iNOS表達(DAB ×200)Fig.2 Expressions of iNOS and COX-2 in rats detected by immunohistochemistry (DAB ×200)

圖3 腎臟組織NF-κB (A)，COX-2 (B)和iNOS (C) mRNA的表達情況Fig.3 mRNA expression of NF-κB (A), COX-2 (B) and iNOS (C) in renal tissue measured by RT-PCR

圖4 大鼠NF-κB蛋白結合強度比較(EMSA)Fig.4 Comparison of binding activity of NF-κB in rat kidney(EMSA)

3 討 論

目前2型糖尿病的具體病因及發(fā)病機制還不十分清楚，而IR被認為是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。近年來，一些臨床流行病學的研究發(fā)現IR個體血中炎癥因子水平升高，存在著低度炎癥表現[5]。與此同時，很多研究也發(fā)現，在非糖尿病的代謝綜合征患者如肥胖、冠心病、高血壓、血脂異常等也存在C反應蛋白(CRP)及白介素6(IL-6)水平的升高，且代謝綜合征組分的增多與炎癥因子水平增高呈正相關[6]。這就提示我們低度的炎癥反應不僅與糖尿病的發(fā)生發(fā)展相關，可能也與IR的發(fā)生有著密切的關系[7-8]。

影響炎癥反應和IR的因素很多，許多免疫細胞和脂肪細胞釋放的多種介質都參與IR的發(fā)生[5]。而NF-κB作為炎癥相關的關鍵標志物，在IR的發(fā)生中可能也起著重要作用。正是基于這種相關關系，我們研究了IR大鼠臟器內是否存在NF-κB及其下游炎癥因子的激活，從而分析NF-κB系統(tǒng)激活是否是造成IR的一個因素。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)Wistar大鼠2個月后成功制備IR模型。與NC組比較，IR組體重明顯增加，體脂含量明顯上升(附睪及腎周脂肪占體重百分比上升)，血糖水平雖在正常范圍但伴有明顯的肥胖、血脂異常、高胰島素血癥。同時，IR組HOMA-IR增高、生化指標及組織學改變均符合IR狀態(tài)。

在糖尿病腎病模型中發(fā)現，腎臟中炎癥細胞的出現早于腎小球和間質的損傷[9]。有研究顯示，無論是在糖尿病發(fā)病的早、中、晚期，活體中的NF-κB表達均有不同程度增加，提示其可能是糖尿病發(fā)病過程的一個重要致病因素，在糖尿病腎臟病變的發(fā)病過程中有著重要作用[10-11]。本研究顯示，在IR大鼠腎臟組織中，無論是NF-κB的表達，還是核蛋白DNA結合力，均顯著增加，從表達與功能兩方面論證了NF-κB的激活在血糖尚未顯著性升高的IR階段就已經發(fā)生，提示早期高血糖可能不是引起NF-κB激活的主要原因，而高胰島素血癥、血脂異常等因素均可能參與NF-κB的激活過程。引起NF-κB激活的因素是綜合性的，因此在對糖尿病的治療過程中，應該注重綜合治療，更有效地減少NF-κB等炎癥因子的激活，從而起到保護臟器防止其受損的作用。

有研究認為，NO是細胞因子介導的β細胞損害及功能異常的潛在介質[12]。有研究者在離體狀態(tài)下使用IL-1β和IFN-γ處理分離的鼠胰島細胞，結果發(fā)現處理的細胞發(fā)生損傷，而這種損傷與iNOS以及NO的產生呈正相關[13]。NO在組織中直接測定非常困難，直接檢測機體組織中iNOS的含量可以客觀反映組織中NO的含量[14]。本研究顯示IR大鼠腎臟組織iNOS的表達明顯增強。iNOS的表達受到多種轉錄因子的調控，NF-κB是其中最主要的一種[15]。吳文等[16]的研究表明，抑制NF-κB的活性可以使糖尿病大鼠腎臟組織中iNOS的表達明顯降低。

COX-2是花生四烯酸代謝合成各種前列腺素的限速酶，屬于誘導型酶，與炎癥反應密切相關，參與多種病理生理過程[17]。COX-2在糖尿病腎病發(fā)展過程中的表達水平上調以及過激化被認為可能是導致糖尿病腎損傷的機制之一，是目前研究腎臟保護常用的靶基因之一。已有研究表明COX-2在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[18]。高糖條件下通過線粒體電子傳遞鏈致使線粒體活性氧簇的產生增加，導致NF-κB激活，誘導COX-2 mRNA和蛋白表達增加。COX-2的表達增加激活了炎癥因子的釋放，炎癥因子通過刺激腎小球系膜細胞的增生，使腎小球肥大，導致腎小球硬化。Nishikawa等[19]研究表明，糖尿病早期腎臟的高濾過是由于COX-2過度表達所致，這種高濾過最終導致腎小球硬化。炎癥因子還能誘導氧自由基增多從而損傷血管內膜，同時誘導血管內皮細胞產生血小板活化因子，促進血栓的形成，導致腎功能的損害。本研究結果顯示，COX-2在IR大鼠腎臟組織中表達顯著增加并伴有腎臟的病理性損害，提示COX-2可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生。COX-2的高表達被證明與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關，且抑制COX-2的表達可以對糖尿病腎臟病變起到保護作用[20-21]。

iNOS和COX-2是NF-κB信號通路下游中重要的兩種蛋白分子。COX-2的啟動子序列中含有NF-κB特異結合序列，該序列與NF-κB結合后可以促進COX-2基因的轉錄。iNOS與COX-2相互協調，可直接損傷細胞的DNA和蛋白質。本研究結果顯示，IR大鼠腎臟組織中存在NF-κB的激活，從而啟動下游靶基因COX-2、iNOS表達的增加，進而導致腎臟組織受損。NF-κB的激活可能是導致IR大鼠腎臟病變的始動因子之一，目前這方面的研究有限，有待進一步研究證實。

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