基于雙啟動引物特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌的P C R方法

徐義剛，李丹丹，張柏棋，劉忠梅，魏冬旭，劉新亮，李蘇龍，*

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江哈爾濱150001；2.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南海口570125；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001）

基于雙啟動引物特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌的P C R方法

徐義剛1，李丹丹2，張柏棋3，劉忠梅1，魏冬旭1，劉新亮1，李蘇龍1，*

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江哈爾濱150001；2.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南海口570125；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001）

以單核細胞增生李斯特氏菌iap基因為靶基因，利用一新型PCR引物設計方法--雙啟動引物（Dual-priming oligonucleotide，DPO），建立了特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌的DPO-PCR方法，測試了DPO-PCR方法退火溫度不敏感性、特異性及靈敏度，并在實踐檢測中進行了初步應用。結果顯示：該方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度為1.51×102CFU/mL；退火溫度不敏感性測試中，與常規PCR引物相比，DPO引物在48～68℃退火溫度范圍內均能夠高效率地擴增靶基因；特異性測試中，DPO-PCR方法能特異地檢測出目標菌，與其他菌株無非特異性擴增反應，比常規PCR方法顯示出更強的特異性。實踐應用證明，利用DPO-PCR方法對130份樣本進行檢測，共計檢出9份單核細胞增生李斯特氏菌陽性樣本，經國標法（GB/T 4789.30-2008）復檢，兩者檢測結果一致，顯示出良好的實用性，為單核細胞增生李斯特氏菌的快速準確檢測提供了新方法。

單核細胞增生李斯特氏菌，iap基因，DPO-PCR方法

LM的常規檢測方法，操作比較繁瑣，包括細菌分離培養、系列生化反應、動力、溶血及毒力實驗等步驟，完成鑒定工作一般需要7～10d，嚴重影響了檢測鑒定周期。全自動免疫熒光檢測方法[5]、PCR方法[6-7]、顯色培養基快速檢測方法[8]和脈沖場凝膠電泳技術[9]的應用促進了LM檢測技術的發展。特別是PCR方法，憑借其快速、靈敏、特異性強的優點，在LM日常檢測工作中發揮著重要作用，極大地縮短了檢測周期，提高了檢測效率。在PCR技術基礎上，又發展了Real-time PCR方法[10]和LAMP方法[11]。然而，常規引物設計不僅要反復優化引物的各項參數，尤其是退火溫度，而且要反復BLAST比對引物自身的特異性，以防止非特異性擴增，費時費力，當設計多重擴增引物時，更需要大量工作來優化引物退火溫度及其特異性。

本研究引入了一種新型的PCR引物設計方法——雙啟動寡核苷酸引物（Dual-Priming Oligonucleotide，DPO），DPO引物與常規引物相比，具有設計簡單、退火溫度范圍寬、特異性強等優點。設計DPO引物時，不需要反復優化引物的各項參數和反應條件，特別是退火溫度，也不需要BLAST反復比對其特異性，有效地簡化了PCR引物設計流程和實驗步驟，更增強了檢測特異性[12-15]。本研究選擇LM高度保守的invasion associated protein（iap）基因為靶基因，基于DPO引物建立了特異性檢測LM的DPO-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111，ATCC 7644）、綿羊李斯特氏菌（ATCC 19119）、英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090）、威爾斯李斯特氏菌（ATCC 35897）、西爾李斯特氏菌（ATCC 35967）、腸出血性大腸桿菌O157∶H7（ATCC 35150）、沙門氏菌（ATCC 10708）、志賀氏菌（ATCC 12022）、空腸彎曲菌（ATCC 33560）、霍亂弧菌（ATCC 14035）、副溶血弧菌（ATCC 27519）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、溶藻弧菌（ATCC 33839）、創傷弧菌（ATCC 33149）、阪崎腸桿菌（ATCC 51329）、嗜水氣單胞菌（ATCC 7966）、小腸結腸炎耶爾森氏菌（ATCC 9610）、變形桿菌（ATCC 49027）、粘質沙雷菌（ATCC 14756）、溶血性鏈球菌（CMCC 32121）、細菌DNA提取試劑盒 購自TIANGEN公司；增菌培養基BPW 購自北京蘭伯瑞公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2購自TaKaRa公司；引物 由上海生工合成。

梯度PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.2 引物的設計

選擇LM保守基因iap為靶基因，設計DPO引物（見表1）。

1.3 細菌基因組DNA的提取

試劑盒提取法，主要用于靈敏度檢測，具體操作詳見說明書。煮沸提取法，主要用于特異性和實踐檢測，方法：取1mL培養菌液，10000r/min離心5min，棄上清，加入150μL無菌水，混勻，沸水浴10min，10000r/min離心5min，取上清液，-20℃保存備用。

1.4 DPO-PCR反應體系與條件

25μL反應體系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）1.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.1μL，Mg2+（25mmol/L）1.5μL，上/下游DPO引物（10μmol/L）各1.0μL，DNA模板0.5μL，ddH2O 16.9μL。反應條件：95℃5min；95℃30s，58℃ 45s，72℃ 45s，30個循環；72℃終延伸10min。

1.5 DPO-PCR退火溫度不敏感性實驗

退火溫度范圍設為48～68℃，與常規PCR引物進行比較，利用設計的DPO引物擴增靶基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

1.6 DPO-PCR靈敏度實驗

將菌體濃度約為1.51×107CFU/mL的LM進行10倍梯度稀釋，使用試劑盒提取每個稀釋度細菌DNA，以此作為模板進行DPO-PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定該方法的靈敏度。

1.7 DPO-PCR特異性實驗

利用建立的DPO-PCR方法檢測1.1中所示菌株，以驗證該方法的特異性。

1.8 方法的實踐驗證

將建立的單核細胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測方法用于實際檢測工作中，并與國標檢測法（GB/T 4789.30-2008食品衛生微生物學檢驗-單核細胞增生李斯特氏菌檢驗）進行比較，以驗證該方法的可行性。

2 結果與分析

2.1 DPO-PCR檢測方法的建立

以單核細胞增生李斯特氏菌iap基因為靶基因，設計DPO引物，建立了單核細胞增生李斯特氏菌DPOPCR檢測方法（圖1）。

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性

結果顯示，在48～68℃退火溫度范圍內，利用DPO引物均能夠高效擴增出靶基因且無非特異性條帶產生（圖2-B），說明DPO引物退火溫度范圍較寬，而常規PCR引物則存在最適退火溫度（圖2-A）。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this work

圖1 單核細胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for LM注：M：DNA marker 2000；1，2：DPO-PCR陽性結果；3：陰性對照。

圖2 DPO-PCR方法退火溫度不敏感性Fig.2 Annealing temperature insensitivity of DPO-PCR method注：A：常規PCR結果；B：DPO-PCR結果；M：DNA marker 100 ladder；1～8：48.3、51.4、53.7、56.4、59.1、61.7、66.1、68.0℃。

2.3 DPO-PCR方法的靈敏度

結果顯示，所建立的DPO-PCR方法能夠有效檢測出濃度為1.51×102CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌，說明該方法的檢測靈敏度為151CFU/mL。

圖3 單核細胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測方法靈敏度Fig.3 Detection sensitivity of DPO-PCR method for LM注：M：DNA marker 2000；1：1.51×107CFU/mL；2：1.51×106CFU/mL；3：1.51×105CFU/mL；4：1.51×104CFU/mL；5：1.51×103CFU/mL；6：1.51×102CFU/mL；7：1.51×101CFU/mL。

2.4 DPO-PCR方法的特異性

結果顯示，利用建立的DPO-PCR方法檢測1.1所示菌株，僅單核細胞增生李斯特氏菌為陽性結果，其他菌株為陰性結果，且無非特異性反應（圖4-B，C），而常規PCR方法存在非特異性反應（圖4-A），說明DPO-PCR方法的特異性較強。

圖4 單核細胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測方法特異性Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for LM注：A：常規PCR方法特異性結果；B：DPO-PCR方法特異性結果；M：DNA marker 2000；1～17為：單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111），單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 7644），腸出血性大腸桿菌O157∶H7（ATCC 35150），嗜水氣單胞菌（ATCC 7966），空腸彎曲菌（ATCC 33560），阪崎腸桿菌（ATCC 51329），沙門氏菌（ATCC 10708），霍亂弧菌（ATCC 14035），副溶血弧菌（ATCC 27519），溶藻弧菌（ATCC 33839），創傷弧菌（ATCC 33149），志賀氏菌（ATCC12022），金黃色葡萄球菌（ATCC29213），粘質沙雷菌（ATCC 14756），變形桿菌（ATCC 49027），溶血性鏈球菌（CMCC 32121），小腸結腸炎耶爾森氏菌（ATCC 9610）；C：DPO-PCR特異性結果；M：DNA marker 2000；1～6為：陽性對照，陰性對照，英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090），綿羊李斯特氏菌（ATCC 19119），西爾李斯特氏菌（ATCC 35967），威爾斯李斯特氏菌（ATCC 35897）。

2.5 方法的實踐驗證

利用建立的DPO-PCR檢測方法對130份涉及進出口食品樣品、市場流通食品樣品和人工樣本進行了檢測，共檢出9份單核細胞增生李斯特氏菌陽性樣本，經國標法（GB/T 4789.30-2008）驗證符合率為100%（見表2），而常規PCR法出現了3份假陽性結果，顯示出所建立的DPO-PCR方法具有良好的可靠性和實用性。

3 結論與討論

以PCR技術為代表的核酸檢測方法，引物設計是保證結果準確、可靠的前提條件。在設計常規PCR引物時，需要反復優化引物的各項參數以及在實驗中優化PCR反應的退火溫度，以實現靶基因的高效率擴增。此外，為確保擴增反應的特異性，對引物序列還需要反復BLAST分析，操作較繁瑣，特別是在設計多重PCR檢測方法時，為獲得較理想的PCR引物組和反應條件，需要的工作量則更大。

表2 DPO-PCR檢測方法的實踐應用Table 2 Application of the DPO-PCR method in practice

本研究引入了一種新型的PCR引物設計方法，即雙啟動寡核苷酸引物（Dual-Priming Oligonucleotide，DPO），建立了單核細胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測方法。與常規PCR引物相比，DPO引物設計相對簡單，實驗中只需先確定DPO引物的短3’-端，長度在6～15bp，保證其GC含量在40%～80%范圍內，然后反相延伸18～25bp，使其Tm值大于65℃，形成DPO引物的長5’-端，中間用多聚次黃嘌呤（poly I）連接，即完成DPO引物設計，不需要優化引物的各項參數，簡化了PCR引物設計步驟。與常規PCR引物存在最適退火溫度相比，DPO引物的特殊結構賦予了其較寬的退火溫度范圍，實驗中，DPO引物在48～68℃退火溫度內均可獲得靶基因序列的高效率擴增且無非特異性擴增反應，所以不需要對退火溫度進行優化，省時省力。DPO引物也為建立多重PCR方法提供了更佳便捷的途徑。

此外，DPO引物的特異性比常規PCR引物更強。由于DPO引物中poly I的氫鍵結合力弱，擴增時，如果DPO引物5’-端或3’-端有3個以上堿基錯配，引物就會與模板脫離，而終止反應，有效地阻斷了非特異性擴增，而引物自身以及引物間難形成二級結構，更提高了擴增效率[15]。特異性實驗結果顯示，利用DPOPCR方法能夠準確地鑒別出目標菌，與其他菌株無交叉反應及非特異性擴增，常規PCR方法的特異性表現相對較差。實踐應用證明，建立的DPO-PCR方法的檢測結果更加準確，顯示了良好的可靠性和實用性，為單核細胞增生李斯特氏菌的檢測提供了更加可靠的手段。

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Dual-priming primers-based PCR method for specific detection of Listeria monocytogenes

XU Yi-gang1，LI Dan-dan2，ZHANG Bai-qi3，LIU Zhong-mei1，WEI Dong-xu1，LIU Xin-liang1，LI Su-long1，*
（1.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Harbin 150001，China；2.Technical Centre of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Haikou 570125，China；3.Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001，China）

In this study，a Dual-priming oligonucleotide（DPO）-based PCR method for specific detection of L.monocytogenes was developed with iap gene as target.Annealing temperature insensitivity，specificity and detection sensitivity of the DPO-PCR method were tested and its preliminary application was carried out in practice.Results showed that the detection sensitivity of the DPO-PCR method was 151CFU/mL.In the annealing temperature insensitivity test，compared with conventional PCR primers，DPO primers were able to efficiently amplify target gene in the annealing temperature range of 48～68℃.In the specificity test，the DPOPCR method showed a higher specificity for the target bacteria than conventional PCR method and no nonspecific amplification reactions were observed in DPO-PCR.In practice，9 L.monocytogenes positive samples from 130 samples were detected by the DPO-PCR method，which was in accordance with the testing results according to GB/T 4789.30-2008，showing a better practicability.The DPO-PCR provided a new method for fast and accurate detection of L.monocytogenes.

Listeria monocytogenes；iap gene；DPO-PCR method

TS207.4

A

1002-0306（2014）10-0086-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.010

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人畜共患病病原菌，可引起敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多等臨床癥狀[1-2]。LM在自然界中廣泛存在，常見于地表水、污水、土壤、青儲飼料和腐敗蔬菜中。LM也是一種食源性致病菌，主要通過食入被污染的雞肉、鮮奶、冰激凌、色拉、凍豬舌、生牛排、蔬菜而感染[3-4]。該菌在4℃環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。因此，快速而準確的檢測方法是預防LM感染和保障食品安全的重要手段。

2013-09-26 *通訊聯系人

徐義剛（1978-），男，博士，高級獸醫師，研究方向：微生物檢測技術。

國家質檢總局科技計劃項目（2012IK157）；質檢公益性行業科研專項（201310126）。