攜抗HER-2抗體PLGA高分子納米超聲造影劑的制備及其體外尋靶實(shí)驗(yàn)

王翠薇 杜晶 楊仕平 胡鶴 李鳳華

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200127；2.上海師范大學(xué)化學(xué)系，上海 200234

近年來(lái)高分子聚合物由于其生物兼容性、生物可降解性及良好的成膜性能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用超聲造影劑[1]，其中以聚乳酸（poly lactic acid，PLA）及聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）應(yīng)用最廣泛。以聚合物為成膜材料制得的微泡包裹空氣或全氟丙烷氣體，產(chǎn)生較強(qiáng)的回聲散射，是理想的超聲造影劑材料。但腫瘤血管內(nèi)皮間隙為400～600 nm，傳統(tǒng)的聚合物微泡僅能局限于血池內(nèi)顯像，限制了其對(duì)血管外腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)能力[2-3]。本研究以PLGA為材料，樟腦為致孔劑，通過(guò)改進(jìn)的雙乳化溶劑揮發(fā)法制備納米級(jí)PLGA超聲造影劑，并將納米粒子與熒光標(biāo)記的抗HER-2抗體連接制備靶向納米超聲造影劑，檢測(cè)其對(duì)乳腺癌SKBr3細(xì)胞的體外尋靶能力和體外顯像效果。

1 資料和方法

1.1 材料和儀器

主要試劑：PLGA（50∶50，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司）；天然D（+）-樟腦、聚乙烯醇PVA1788低黏度型（醇解度87.0～89.0 mol/mol）及甘露醇（阿拉丁試劑上海有限公司）；二氯甲烷（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）；全氟丙烷氣體（上海人杰靈光學(xué)儀器有限公司）；異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水；異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-抗HER-2抗體（上海億欣生物科技有限公司）；NHS/EDC（百靈威試劑，上海）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（賽默飛世爾科技）；多聚甲醛、DAPI（Sigma，美國(guó)）。

主要儀器：超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；湘儀H-1650高速離心機(jī)；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，日本）；馬爾文納米粒度電位分析儀（ZEN3690，德國(guó)）；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5Ⅱ，德國(guó)）；離子濺射儀（JFC-1100，日本）。

細(xì)胞株：乳腺癌SKBr3細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 納米超聲造影劑的制備

用改進(jìn)的雙乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA納米粒子：①精確稱取天然樟腦12.5 mg，溶于5 mL二氯甲烷；稱取PLGA 125 mg，亦溶于二氯甲烷；磁力攪拌使充分溶解，得到無(wú)色透明溶液。②取PVA溶液（3%，W/V）1 mL，注入上述溶液，獲得水-油兩相液；在冰水浴條件下用聲振儀進(jìn)行第1次乳化（130 W，on 4 s/off 2 s，180 s），獲得呈乳白色的一次乳化液。③將一次乳化液注入20 mL PVA溶液（3%，W/V）中，進(jìn)行第2次乳化（130 W，on 4 s/off 2 s，180 s）。④將二次乳化液倒入100 mL異丙醇溶液（5%，V/V）中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使溶劑揮發(fā)、粒子表面固化。⑤將旋蒸后獲得的混合液分裝入15 mL離心管，12000 r/min離心10 min；棄上清液，取白色沉淀物復(fù)溶于超純水中再次離心，重復(fù)3次；在沉淀物中加入微量甘露醇，分散于1 mL超純水中，以鋁箔包裹放入-20 ℃冰箱冷凍。⑥放入冷凍干燥機(jī)中24 h進(jìn)行冷凍干燥，獲得白色粉末，抽真空后注入全氟丙烷氣體。⑦將產(chǎn)品密封避光保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 PLGA納米粒子的表征

用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察PLGA空心納米粒子的形態(tài)：將PLGA空心納米粒子分散在超純水中，取適量分散均勻的樣品涂布于鋁箔粗糙面，制成干燥樣品后用離子濺射儀進(jìn)行噴金，在掃描電子顯微鏡下對(duì)粒子大小、形態(tài)、表面、分散性進(jìn)行觀察。

用納米粒度電位分析儀將PLGA空心納米粒子分散于超純水，常溫下測(cè)量PLGA空心納米粒子的水合粒徑及多分散指數(shù)。

用透射電子顯微鏡確認(rèn)粒子是否具有空心結(jié)構(gòu)：將PLGA粒子分散液滴到覆有碳膜的銅網(wǎng)上，用新鮮配制的磷鎢酸溶液（1%，W/V）進(jìn)行染色后在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 靶向納米超聲造影劑的制備

室溫下將PLGA 納米粒子（1 mg/mL）分散液與耦聯(lián)活化劑NHS/EDC孵育30 min， 16000 r/min離心10 min；棄上清液，復(fù)溶在PBS中，重復(fù)2次，去除未反應(yīng)的耦聯(lián)活化劑NHS/EDC。將活化后的PLGA納米粒子分散在200μL PBS中，加入25μL 1μg/μL FITC-抗HER-2抗體，混合均勻后孵育30 min，以16000 r/min離心10 min；將沉淀物分散在PBS中，重復(fù)2次，去除游離抗體，獲得靶向納米超聲造影劑，分散在50μL PBS中備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和爬片的制作

在37℃、5% CO2、完全飽和濕度條件下培養(yǎng)兩種乳腺癌細(xì)胞（SKBr3細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SKBr3細(xì)胞，用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞。兩種細(xì)胞均以1×104/皿的密度培養(yǎng)于皿底厚度為0.17 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后24 h開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察靶向納米超聲造影劑體外尋靶及顯像效果

取SKBr3細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞各一皿，分別加入25μL FITC-抗HER-2抗體；另取SKBr3細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞各一皿，分別加入25μL 靶向納米超聲造影劑。4皿細(xì)胞均孵育20～30 min，然后用PBS洗3遍，去除未結(jié)合的抗體及靶向納米超聲造影劑。用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用DAPI進(jìn)行染核。以上操作均在避光條件下進(jìn)行。

1.7 靶向納米超聲造影劑體外成像實(shí)驗(yàn)

靶向PLGA納米粒子的體外成像效果：精確稱取一定質(zhì)量的PLGA空心納米粒子粉末，制備成1 mg/mL的分散液，取5 mL注滿橡膠塞封口的透明塑料樣品管，同時(shí)取5 mL無(wú)氣水注入同樣的樣品管中作為空白對(duì)照組。以無(wú)氣水為透聲窗，用百勝M(fèi)yLab Twice超聲診斷儀進(jìn)行實(shí)時(shí)灰階成像（中心頻率22 MHz超高頻探頭，機(jī)械指數(shù)為0.06）。

2 結(jié)果

將制得的PLGA納米粒子分散液樣品烘干噴金后于掃描電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)粒子呈球形，表面較光滑，形態(tài)規(guī)則，分散性好，粒子之間未見(jiàn)團(tuán)聚（圖1）。納米粒度電位分析儀測(cè)得粒子平均粒徑為（152.00±58.08）nm，多分散指數(shù)（polydisperse index，PDI）為0.221，表明粒子大小分布尚均勻（圖2、3）。

圖1 掃描電子顯微鏡下觀察PLGA納米超聲造影劑粒子

圖2 PLGA納米超聲造影劑粒子的平均粒徑（size）和多分散指數(shù)（DLS）

圖3 透射電子顯微鏡下觀察經(jīng)磷鎢酸溶液染色后的PLGA納米粒子的空心結(jié)構(gòu)

如圖4A所示，激光共聚焦顯微鏡下觀察到FITC-抗HER-2抗體與SKBr3細(xì)胞連接的成功率較高，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色激發(fā)顯示為藍(lán)色熒光，細(xì)胞膜上激發(fā)獲得環(huán)狀或點(diǎn)狀綠色熒光，表明抗體成功結(jié)合到細(xì)胞膜上。圖4B顯示部分SKBr3細(xì)胞與靶向納米超聲造影劑結(jié)合，細(xì)胞膜顯示點(diǎn)狀的綠色熒光，表明靶向納米超聲造影劑可較多并牢固地連接到乳腺癌SKBr3細(xì)胞表面，未被PBS洗脫。圖4C與圖4D中，MDA-MB-231細(xì)胞膜表面未見(jiàn)抗體或靶向高分子造影劑黏附現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)該靶向造影劑在體外對(duì)HER-2受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性親和力。

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察

將濃度為1 mg/mL的納米靶向造影劑注滿體積為5 mL的樣品管內(nèi)，并以含5 mL脫氣水的樣品管為參考，用高頻線陣探頭觀察靶向納米高分子超聲造影劑的體外顯影能力。結(jié)果如圖5所示，PLGA造影劑組顯示為點(diǎn)狀高回聲，細(xì)膩均勻，對(duì)照組的水顯示為無(wú)回聲液性區(qū)。

圖5 PLGA納米靶向造影劑體外成像

3 討論

用高分子聚合物PLGA為成膜材料制備獲得的超聲造影劑具有生物兼容性、生物可降解性，在生物體內(nèi)可代謝為無(wú)毒的二氧化碳和水排出體外，對(duì)生物體無(wú)害，是理想的超聲造影劑材料，具有良好的應(yīng)用前景[4-5]。

本研究中，將樟腦溶解于主乳化劑中，通過(guò)改進(jìn)的雙乳化溶劑揮發(fā)法制備包裹樟腦的PLGA粒子，經(jīng)冷凍干燥，樟腦升華，充入全氟丙烷氣體獲得PLGA納米超聲造影劑。該粒子表面較光滑，形態(tài)規(guī)則，平均粒徑為（152.00±58.08）nm，粒徑呈單峰分布，PDI為0.221，理論上可穿透腫瘤血管內(nèi)皮間隙（400～600 nm）進(jìn)入腫瘤組織，通過(guò)“被動(dòng)靶向”作用使血管外靶組織顯像成為可能，從而克服傳統(tǒng)微泡造影劑僅能于血管內(nèi)顯像的局限性[6]。PLGA制備的納米造影劑表面含有大量羧基，而單克隆抗體、配體、各種特異性短肽等活性物質(zhì)多為蛋白，本身含有大量氨基，羧基與氨基可通過(guò)共價(jià)鍵耦聯(lián)。本研究以EDC/NHS作為耦聯(lián)活化劑，使活化PLGA上的羧基與單克隆抗體上的氨基結(jié)合，通過(guò)碳二亞胺法技術(shù)成功制得攜抗HER-2 抗體的靶向PLGA納米超聲造影劑，并驗(yàn)證了其對(duì)HER-2受體高表達(dá)的乳腺癌SKBr3細(xì)胞的特異性結(jié)合能力。這種攜抗HER-2 抗體的納米超聲造影劑有望在體內(nèi)通過(guò)主動(dòng)靶向作用，使超聲造影劑以更高的濃度聚集在乳腺癌組織，達(dá)到定向增強(qiáng)顯影的目的。

透射電子顯微鏡證實(shí)，本研究中制備的納米粒子具有空腔結(jié)構(gòu)，空腔結(jié)構(gòu)的存在及全氟丙烷氣體的導(dǎo)入可產(chǎn)生較強(qiáng)的回聲散射。PLGA納米超聲造影劑與傳統(tǒng)的微泡造影劑的大小差別較大，因此未采用超聲診斷儀上適用于傳統(tǒng)微泡造影劑的造影模式成像。初步體外超聲成像實(shí)驗(yàn)證明，PLGA靶向納米造影劑在高頻超聲條件下具有較好的顯像效果。

PLGA納米粒子表面的羧酸鍵（—COOH）及內(nèi)部的空腔使其不僅可成為靶向超聲造影劑，還可在粒子表面連接藥物或在粒子內(nèi)部定量封裝藥物，達(dá)到對(duì)腫瘤靶向診斷及治療的目的[7]，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有診斷與治療雙重功能的PLGA納米靶向載藥造影劑打下良好的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功制備了攜抗HER-2抗體的PLGA靶向納米超聲造影劑，能與HER-2受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞體外特異性靶向結(jié)合，且體外顯像效果較好。

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