瑤藥天鉆的水分及馬兜鈴酸A含量測定＊

張亞洲 ，唐 其，陳 兵，唐春風(fēng)，覃山丁 ，樊蘭蘭

(1．廣西壯族自治區(qū)藥用植物園天然藥物化學(xué)中心，廣西 南寧 530023;2．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

瑤藥天鉆是中國特有植物馬兜鈴科馬兜鈴屬植物廣西馬兜鈴 Aristolochia kwangsiensis Chun et How ex C．F．Liang 的塊根[1]。現(xiàn)已從天鉆中分離得到了尿囊素、馬兜鈴酸、β－谷甾醇、6－甲氧基去硝基馬兜鈴酸甲酯、6－甲氧基馬兜鈴酸A甲酯及木蘭花堿[2－3]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，天鉆總生物堿具有解痙、鎮(zhèn)痛作用[4－5];馬兜鈴酸主要有抗腫瘤、致突變、腎臟毒性作用[3－6];天鉆提取物對臨床各種疾患所致平滑肌痙攣性腹痛的止痛效果較好[7－10]。天鉆在民間現(xiàn)仍作為抗腫瘤、止痛藥物使用，而其有效成分至今尚未明確。馬兜鈴酸A是否在天鉆藥材中普遍存在，其含量如何，值得探討。為此，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定了天鉆藥材中馬兜鈴酸A的含量，旨在為藥材的安全使用提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀;DAD檢測器;色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4．60 mm，5 μm)。乙腈、甲醇(色譜純，成都科龍試劑有限公司);水為自制純凈水;馬兜鈴酸A對照品(自制，含量98．327%);天鉆藥材采集情況見表1。

2 方法與結(jié)果

2．1 藥材水分測定

參照2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅨG干燥失重測定法，對11批藥材樣品的水分進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

2．2 馬兜鈴酸A含量測定(HPLC法)[11－13]

2．2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4．60 mm，5 μm);流動相:乙腈－含0．34%三乙胺和0．94%乙酸的水溶液，梯度洗脫(見表 3);流速:0．8 mL/min;檢測波長:260 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在此條件下，色譜分離良好，色譜圖見圖1。

表1 藥材樣品采集情況表

表2 天鉆藥材水分測定結(jié)果(%)

表3 流動相梯度洗脫表

圖1 馬兜鈴酸A高效液相色譜圖

2．2．2 樣品超聲提取方法選擇

馬兜鈴酸A溶于甲醇，故樣品超聲提取所用溶劑選用甲醇。稱取藥材樣品4份，分別加入甲醇，超聲15，30，45，60 min后，再用甲醇稀釋到刻度，搖勻后用微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL。結(jié)果甲醇超聲提取15，30，45，60 min時，馬兜鈴酸 A提取率分別為95.03%，98.66%，98.92%，100．00%。可見，超聲提取30 min時已提取較完全，從節(jié)約時間方面考慮，樣品用超聲提取30 min效果較理想。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:稱取馬兜鈴酸A對照品21．8 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解后，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品貯備液。取貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液A。再取貯備液25 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液B。再取溶液B 5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液C。再取溶液C 5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液D。再取溶液D 5 mL，置10 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液E。再取溶液E 5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液F。取貯備液及溶液A－F，各進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 X=0．009 8 A+0．050 7，r=0．999 99(n=7)。結(jié)果表明，馬兜鈴酸A質(zhì)量濃度在1．703～109 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，符合檢測要求。

精密度試驗:取同一對照品溶液，搖勻后進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次。結(jié)果平均峰面積值為 118．42，RSD=0．71%(n=6)，表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗:精密稱取藥材樣品(編號8)0．503 3 g，用甲醇超聲30 min，放冷后用甲醇稀釋至刻度，搖勻后，用微孔濾膜過濾，分別于 0，2，4，6，8，12 h 時進(jìn)樣測定。結(jié)果的 RSD 為 0．26%(n=6)，表明樣品溶液在12 h內(nèi)測定較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:精密稱取同一藥材樣品(編號8)6份，依法制備樣品溶液并測定含量。結(jié)果的 RSD=0．55%(n=6)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的藥材樣品(編號6)0．23 g，平行9份，分別加入已知樣品中馬兜鈴酸A含量的125%，100%，75%的對照品，按樣品溶液制備方法處理，依法進(jìn)樣測定含量，計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 馬兜鈴酸A加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2．3 樣品水分及含量測定

按照2．1及2．2項下方法，依法測定11批藥材樣品水分及馬兜鈴酸A含量，結(jié)果見表5。

表5 藥材樣品中水分及馬兜鈴酸A含量測定結(jié)果

3 討論

天鉆藥材在民間常用于抗腫瘤、鎮(zhèn)痛，其活性成分尚不明確，是否有潛在的腎毒性危害，也還未引起足夠重視。因此，對天鉆藥材中含有的馬兜鈴酸A進(jìn)行測定非常必要。

本研究結(jié)果顯示，11批樣品中馬兜鈴酸A含量為0．0174% ～0．206 4%，含量差異較大，最高者是最低者的12倍。另外，自購藥材中馬兜鈴酸A含量均較低，可能與采集后放置時間較長有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

天鉆為少數(shù)民族用藥，含有馬兜鈴酸A，但含量為多少，使用中是否會造成危害，一直尚未明確。馬兜鈴酸A具有腎毒性已較為明確，天鉆藥材中均含馬兜鈴酸A，使用過程中是否會產(chǎn)生毒性作用，值得重視。無論如何，應(yīng)避免大量、超量使用，或是不用。

[1]戴 斌．中國現(xiàn)代瑤藥[M]．南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2009:79－81．

[2]周法興，梁培瑜，瞿賜荊，等．廣西馬兜鈴的化學(xué)成分[J]．藥學(xué)通報，1981，16(4):56 －57．

[3]周法興，梁培瑜，瞿賜荊，等．廣西馬兜鈴的化學(xué)成分研究[J]．藥學(xué)學(xué)報，1981，16(8):638 － 640．

[4]廣西壯族自治區(qū)醫(yī)藥研究所化學(xué)室．圓葉馬兜鈴等三種中草藥的鎮(zhèn)痛有效部位研究[J]．中草藥通訊，1977，8(17):39．

[5]廣西壯族自治區(qū)醫(yī)藥研究所化學(xué)室．圓葉馬兜鈴等三種中草藥的鎮(zhèn)痛實驗和臨床觀察小結(jié)[J]．中草藥通訊，1977，8(10):30－33．

[6]洪庚辛，韋寶偉，賈文才，等．圓葉馬兜鈴總生物堿鎮(zhèn)痛作用機制的研究[J]．中藥通報，1985，10(1):38 －40．

[7]茍 蓉，周 莉，劉 芳．馬兜鈴酸腎病發(fā)病機制的研究進(jìn)展[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(2):215－217．

[8]熊靜悅，譚正懷．馬兜鈴酸的主要毒性作用及其相關(guān)機制[J]．四川中醫(yī)，2011，29(9):39 －42．

[9]Priestap HA，Torres MC，Rieger RA，et al．Aristolochic acid I metabolism in the isolated perfused rat kidney[J]．Chem Res Toxicol，2012，25:130－139．

[10]Arltl VM，Zuol J，Trenzl K，et al．Gene expression changes induced by the human carcinogen aristolochic acid I in renal and hepatic tissue of mice[J]．Int J Cancer，2011，128:21 － 32．

[11]孔衛(wèi)東，張立新．高效液相色譜法測定產(chǎn)復(fù)欣顆粒中阿魏酸含量[J]．中國藥業(yè)，2013，22(16):47 －48．

[12]段吉平，馮 麗，張立濤．高效液相色譜法測定當(dāng)藥中龍膽苦苷含量[J]．中國藥業(yè)，2013，22(4):39 －40．

[13]吳海霞，郭迎霞，曹宇峰．高效液相色譜法測定腎石消膠囊中大黃素含量[J]．中國藥業(yè)，2013，22(5):49 －50．