維通靜脈注射乳劑制備工藝研究＊

王成蹊 ，秦 飛 ，周 靜 ，周 毅 ，李 磊 ，毛 萍 ，侯連兵

(1．廣東藥學院藥科學院，廣東 廣州 510006;2．南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東 廣州 510515;3．內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110;4．廣州醫科大學，廣東 廣州 510182)

維通注射液是南方醫科大學藥學部在驗方常通口服液的基礎上開發的用于防治盆腹腔術后粘連的復方中藥注射劑，主要由丹參、大黃等中藥組方，具有益氣養血、理氣化瘀的的功效。試驗證明，維通注射液可防治大鼠手術后腹腔粘連，顯著降低大鼠術后盲腸組織內羥脯氨酸含量[1]，亦可降低手術后兔體內羥脯氨酸與纖維蛋白原含量，病理切片表明其可抗炎、改善纖維化、修復創傷組織[2]。前期試驗測得維通注射液的半數致死量為8．4 mg/kg，注射此劑小鼠會出現一系列中毒現象[3]。為進一步降低毒性并解決藥物中部分脂溶性成分難溶的情況，本試驗采用二步乳化法制備了維通靜脈注射乳劑(WIE)，并采用溶血試驗研究其安全性。

1 儀器、試藥與動物

Platisil ODS色譜柱(美國Dikma公司);CTO－20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);Nano ZS90型馬爾文激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司);FA25型高剪切分散乳化機(德國FLUKO公司);M－110EH型高壓均質機(美國Microfluidics公司)。注射用大豆油(廣州漢方現代中藥研究開發有限公司);中鏈甘油三酯、注射用蛋黃卵磷脂、注射用油酸均購自德國Lipoid公司;注射用甘油(汕頭古漢紫光氨基酸有限公司);甲醇、乙腈(美國Fisher Scientific公司)，其余試劑均為分析純。新西蘭家兔(南方醫科大學實驗動物中心)。

2 方法與結果

2．1 乳劑制備

經過預試驗初步得到靜脈注射乳劑制備方法，將脂溶性組分分散于混合油相(含MCT10g、大豆油10g)中，加入油酸、維生素E，60℃磁力攪拌溶解，制得油相。稱取水溶性組分、蛋黃卵磷脂、甘油，分散于60 mL水相(注射用水)中，60℃攪拌溶解，制得水相。于60℃高速(9 500 r/min)剪切攪拌，將油相緩慢滴加入水相中，共剪切約10 min，用注射用水稀釋定容至100 mL，制得初乳。25℃下轉移至高壓均質機中均質。裝瓶，充氮，密封，105℃水浴滅菌30 min，冰水浴迅速降溫，即得WIE。

2．2 組方優化

由于維通注射液由脂溶性和水溶性2種藥物構成，2種藥物會分別溶解于靜脈乳的油相和水相，因此有必要對不同油相、不同乳化劑、不同穩定劑進行正交試驗，觀察在不同條件下乳劑的穩定性，尋找有利于2種藥物穩定溶解的最佳處方。在初步固定工藝的基礎上將油相、卵磷脂、油酸的用量這3個因素作為考察對象，每個因素選3個水平，采用 L9(34)正交試驗，制備不同批次乳劑，以乳劑在80℃的穩定時間 K作為處方穩定性評價指標，研究處方的最佳配比。結果最佳處方組成為油相20%，卵磷脂 1．0%，油酸 0．06% 。

2．3 制備工藝優化

2．3．1 滅菌條件考察

在確定靜脈注射乳劑處方基礎上，取同一批靜脈注射乳劑分成3組，每組分裝3只西林瓶，充氮氣，按不同條件消毒，研究WIE在不同高壓滅菌方法下的耐熱性。試驗使用的3種條件分別為105℃高壓滅菌30 min，115℃高壓滅菌25 min，121℃高壓滅菌20 min。滅菌后觀察靜脈注射乳劑性狀，結果見表3。可見，其中115℃高壓滅菌25 min和121℃高壓滅菌20 min均發生破乳分層現象，105℃高壓滅菌30 min未見破乳，滅菌效果最好。因此，滅菌條件選擇為105℃高壓滅菌30 min。

2．3．2 熱壓滅菌對pH的影響

由于磷脂遇熱易水解產生脂肪酸而降低靜脈注射乳劑的pH，影響其穩定性及包封率，故需考察熱壓滅菌對制劑pH的影響。按照試驗優選后的處方配置靜脈注射乳劑，任取1個樣品，測定其粒徑為200．2 nm，分別裝到5個西林瓶內，用氫氧化鈉和鹽酸溶液分別調節制劑的 pH 至 6．0，7．0，8．0，9．0，10．0，并 105 ℃滅菌30 min，考察滅菌前后乳劑的pH、外觀變化。結果見表1。由于pH經高壓滅菌后會降低，因此在制得脂肪乳后應先將其pH調整至9．0，再滅菌。pH為6．2的乳劑滅菌后發生破乳現象，故無法測量。結果見表1。

表1 熱壓滅菌對乳劑pH的影響

2．3．3 不同均質壓力和次數對乳劑的影響

按處方(0．002%DA，0．02%DB，20% 油相，0．06% 油酸，0．5%維生素E，2．5%甘油)制備初乳后，將初乳分成3批，各600 mL，3批分別在5 000 psi，10 000 psi和20 000 psi壓力下用高壓均質機均質乳化，并在均質乳化第 1，2，3，4，6，8，12，16 次留樣，測定樣品粒徑并觀察樣品性狀。結果樣品性狀均為白色乳狀液體，無油花，粒徑見表2。可見，隨著均質次數的增加，靜脈注射乳劑的粒徑逐漸減小，最后趨向于一個恒定值，一般情況下均質3～4次后粒徑大小和該值相差不大。但當使用不同壓力時，該恒定值也存在較大差異，故需在正交試驗中尋找最佳成乳壓力。

表2 不同均質壓力和次數對乳劑粒徑的影響(nm)

2．3．4 制備工藝條件優化

脂肪乳劑質量的好壞主要與乳化技術工藝有關。根據文獻[5]對脂肪乳注射液生產的經驗，列出制備工藝中對脂肪乳質量可能影響較大的各個因素和水平，選擇混合溫度、混合時間、均質壓力作為影響因素，進行正交試驗，以乳劑在80℃的穩定時間K作為處方穩定性評價指標，計算結果。得最佳工藝組成為混合溫度為60℃，混合時間為10 min，均質壓力為20 000 psi。

2．4 理化性質考察

2．4．1 亞微乳的粒徑、ζ－電位、黏度測定

精密量取3批維通靜脈注射乳劑樣品各0．5 mL，以注射用水稀釋定容至20 mL，使用粒度分布分析儀分別測定粒徑和ζ－電位，結果平均粒徑為(191．03±2．81)nm，平均 ζ－電位為(－38．83±2．40)mV，另精密量取3批維通靜脈注射乳劑樣品，使用黏度計測得平均黏度為(1．85 ±0．02)mPa·s。

2．4．2 維通靜脈注射乳劑中有效成分含量測定

由于WIE成分較多，本試驗選擇丹參中具有代表性的藥物丹參酮ⅡA作為含量測定指標。

色譜條件與方法學考察結果:色譜柱為C18柱;流動相為甲醇－水(85∶15);流速為1．0 mL/min;柱溫為30℃;進樣量為20 μL;檢測波長為270 nm。線性回歸方程為 Y=0．000 012 73X+0．012 698，R2=0．999 944 8，精密度的 RSD 為 0．13% 。

含量測定:取 500 μL(含 DA 10 μg)WIE 于試管中，加入0．1 mol/L NaOH 200 μL，并加入氯仿 1 000 μL，渦旋振蕩 5 min，40℃避光超聲20 min，繼續渦旋混合5 min，15 000 r/min離心10 min，液體分3層，上層為上清液，中間層為磷脂層，下層為氯仿層(呈淡紅色)，取下層氯仿液，置減壓干燥箱40℃干燥，殘渣加入1 mL甲醇溶解，定容，用0．45 μm濾膜過濾，于270 nm波長處檢測樣品含量。色譜圖見圖1。結果吸收峰面積 A=770 408，代入標準曲線計算得丹參酮ⅡA含量為98．2%，證明制劑質量良好。

圖1 維通靜脈注射乳劑丹參酮ⅡA高效液相色譜圖

2．5 體外溶血試驗

取家兔血，5 mL置抗凝離心管中，放入裝載小玻璃珠的潔凈錐形瓶中振搖10 min，以除去纖維蛋白原，離心之后棄上清液，將紅細胞層用0．9%氯化鈉注射液沖洗4次，每次10 mL，每次沖洗后3 000 r/min離心20 min，除去上清液，直至上清液不呈紅色為止，然后吸取一定量紅細胞，用0．9%氯化鈉注射液按體積比稀釋制備2%紅細胞混懸液，4℃冰箱中冷藏備用。

取7支試管，編號為1～7，溶血試驗設計見表3，分別在各管內加入適量2%紅細胞混懸液和0．9%氯化鈉注射液(7號管內加蒸餾水做陽性對照)，置37℃恒溫水浴中30 min后又分別加入不同量的WIE(6號管做陰性空白對照)，輕搖至均勻后放回37 ℃恒溫水浴中，分別于 0．5，1，2，3，4 h 時觀察試管內紅細胞溶血情況。試驗結束時，將各試管以2 500 r/min的速率離心10 min后，分別取上清液在550 nm波長處比色，以0．9%氯化鈉注射液管上清液為空白，蒸餾水管上清液作為100%溶血，計算各試管的溶血率[4]。結果見表4。可見，在各時間點1～6管均未發生明顯溶血現象，說明WIE組與陰性對照組無溶血現象;7號管在各個時間點均發生溶血現象。離心后比色得到溶血率在0．09%～1．22%之間，符合衛生部藥品標準中溶血率不得超過5%的規定。因此，本試驗制備的WIE滲透壓在安全范圍內，且不含溶血成分，作為注射劑可以安全使用。

表3 維通靜脈注射乳劑溶血試驗設計(mL)

3 討論

脂肪乳注射液是以植物油(主要成分為脂肪酸三酰甘油)為油相，輔以磷脂為乳化劑、等滲劑和注射用水乳化制得的水包油(O/W)型乳劑，是一種以脂肪油為軟基質而被磷脂膜包封的微粒體分散系[5]。本試驗制備的靜脈乳即為注射用脂肪乳，與其他微粒制劑相比較，載藥脂肪乳注射液具有其獨特的優點:將藥物包裹于內相或界面層中，包封率高，提高藥物穩定性并降低藥物刺激性和毒性;能夠耐受終端高壓蒸汽滅菌，保證了制劑的安全性;載藥量高，確保了藥物的療效[5]。

表4 維通靜脈注射乳劑溶血試驗結果

中藥靜脈注射乳劑已有數個相應產品上市。如鴉膽子油亞微乳注射劑[6]、薏苡仁油亞微乳注射劑、大蒜油亞微乳等[7－8]。本試驗使用的藥物維通靜脈注射乳劑的主藥來自于丹參、大黃等植物提取物，其中部分組分具有脂溶性強而水溶性弱的性質，無法直接溶解于水制備注射液，故采用先將脂溶性組分溶解于油相，再將水溶性組分溶解于水相后，制備靜脈注射乳劑。通過正交試驗等，分別對處方和工藝進行優化，獲得生產乳劑的最佳條件。作者用超速離心法測定出藥物在油相中的含量為98．2%，表明制劑符合試驗設計要求。

采用紫外分光光度法測定溶血度準確、快速且重現性好，彌補了試管法判斷誤差較大之不足。試驗表明，WIE與體積分數為2%的兔紅細胞混懸液于37℃孵育4 h不發生溶血現象，說明制劑較為安全。

[1]趙 潔，曾煦欣，侯連兵．維通注射液對大鼠術后腸粘連的防治作用研究[J]．中國藥房，2009，20(21):1 611 －1 613．

[2]曾煦欣，趙 潔，黃嗣航，等．維通注射劑對兔腹腔術后粘連防治作用的研究[J]．中藥材，2008，31(4):580 －583．

[3]鐘延松，曾煦欣，侯連兵．維通注射液的急性毒性實驗研究[J]．中藥材，2008，31(11):1 720 －1 722．

[4]黎 玲，王東凱，李林穗，等．注射用WIE的制備[J]．沈陽藥科大學學報，2007，24(12):736 －739．

[5]趙明明，蘇 敏，唐 星．載藥脂肪乳注射液的研究進展[J]．沈陽藥科大學學報，2010，27(12):933－935．

[6]游榮輝，叢龍波，袁海龍．靜脈亞微乳研究進展及其在現代中藥研究中的應用[J]．中草藥，2007，38(6):946 －948．

[7]Guo T，Chu XQ，Yan M，et al．The effect of anti－ eumycete and safe of garlic oil submicron emulsions[J]．J Shenyang Pharm Univ，2005，22(6):458－462．

[8]Guo T，Chu XQ，He Jin，et al．Investigation on stabilities of garlicoil submicron emulsion[J]．Pharm J Chin PLA，2005，21(2):81 － 84．