Orai3參與了HUVECs外鈣敏感受體介導的鈣內流和NO生成*

王臘梅， 鐘 華， 趙 慧， 王 靜， 龐麗娟， 孫志萍， 何 芳△

(1新疆地方病與民族高發病教育部重點實驗室，石河子大學醫學院2病理生理教研室，3病理教研室，4醫學機能實驗中心，新疆 石河子832002)

近年來廣泛的研究證實鈣池操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOC)和受體操縱性鈣通道(receptor-operated Ca2+channels，ROC)是非興奮細胞介導外Ca2+內流的重要通道，參與多種生理和病理生理過程，對維持細胞內游離Ca2+濃度穩定具有重要作用。SOC激活依賴內質網(endoplasmic reticulum，ER)鈣庫耗竭后ER腔內Ca2+濃度下降，對Ca2+有高度選擇;ROC激活不依賴鈣庫耗竭，而依賴 G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor，GPCR)-Gq/11-磷脂酶 C(phospholipid lipoidase，PLC)-磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate，PIP2)-二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)-蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路產生的DAG，對Ca2+缺乏選擇性。研究發現Ca2+通道蛋白Orai由于其在介導鈣庫操縱的鈣內流(store-operated calcium entry，SOCE)中的作用而受到廣泛關注。Orai家族最早被認為是SOC或稱鈣釋放激活鈣離子通道(Ca2+release-activated Ca2+channel，CRAC)的構成蛋白，是4次跨膜蛋白，包括 Orai1、Orai2 和 Orai3［1］。關于Orai的研究起步較晚，在參與構成SOC介導的SOCE上存在爭議。Mercer等［2］在異源表達基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)、Orai1、Orai2和Orai3的HEK293細胞中發現，所有Orai蛋白都能增加SOCE，且增強 SOC的作用功效依次是Orai1＞Orai2＞Orai3，其中 Orai3能部分代償 Orai1敲除對細胞產生的影響。DeHaven等［3］的研究顯示，Orai1、Orai2和Orai3通道都能被胞外Ca2+抑制，且Orai3通道對鈣庫排空過程有一定的抑制作用。

鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaR)為GPCR超家族中C亞族的成員。我們前期的研究發現:在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，CaR 激活介導了［Ca2+］i升高及一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成過程［4-5］，SOC和ROC以協同的方式參與了此過程，且瞬時受體電位陽離子通道C亞族成員1(transient receptor potential cation channel，subfamily C，member 1，TRPC1)、STIM1和Orai1為參與上述過程的關鍵組件之一，那么Orai3是否參與了CaR經SOC和ROC介導的Ca2+內流和NO生成呢?本研究擬在前期工作基礎上以原代培養的HUVECs為研究對象，構建Orai3干擾質粒，通過分別檢測mRNA和蛋白表達篩選出抑制效率高的干擾質粒，并觀察Orai3基因沉默后對HUVECs中［Ca2+］i和 NO生成的影響，試圖闡明Orai3在CaR介導［Ca2+］i和NO生成中的作用和機制，為心腦血管疾病防治提供新思路。

材料和方法

1 材料

健康孕婦剖宮產的新鮮臍帶(來自華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，經倫理道德委員會批準和個人知情同意)。

2 主要試劑

內皮細胞培養基(ScienCell);蛋白酶抑制劑(Calbiochem);兔抗人Orai3多克隆抗體和鼠抗βactin單克隆抗體(Santa Cruz);Ⅱ抗(ProteinTech);ECL發光試劑盒(Thermo);逆轉錄試劑盒與realtime RT-PCR試劑盒(TaKaRa);LipofectamineTM2000與OPTI-MEM(Invitrogen);Fura-2/AM(Invitrogen);DAF-FM DA(NO熒光探針;Beyotime);G418(Biosharp);去內毒素高純度質粒抽提試劑盒(Omega);shRNA(上海吉凱基因化學技術有限公司);引物(友名生物技術有限公司);其余均為國產分析純試劑。

3 主要儀器

Ca2+成像系統FV300、倒置熒光顯微鏡IX-70和激光共聚焦顯微鏡FV300(Olympus)。

4 方法

4.1 HUVECs的培養與鑒定 依據本研究室以前的方法培養HUVECs并傳代［4］，用細胞內Ⅷ因子相關抗原進行免疫細胞化學染色，鑒定HUVECs，取生長狀態良好的第2～5代細胞用于實驗。

4.2 Orai3基因的shRNA構建及轉染 (1)遵循shRNA的設計原則，根據GenBank中人Orai3的cDNA序列(NM_152288)，以其同源的編碼DNA序列(coding DNA sequences，CDS)部分設計、合成 3條shRNA，分別命名為 shOrai3-75、shOrai3-76和 shO-rai3-77，上述序列經BLAST軟件分析，與人類基因外顯子無同源性，排除對其它基因的非特異性干擾，并與載體連接構建成重組質粒。(2)轉染:細胞生長至70%～90%時進行轉染，實驗分為未轉染組即空白對照組(control組)、空質粒組(vehicle組)和特異性質粒轉染組即實驗組(Orai3 shRNA)。以6孔板的1個孔為例，首先取一無菌EP管加250 μL OPTI-MEM培養基和 5 μL LipofectamineTM2000(Invitrogen)，輕輕混勻。再取另一無菌EP管加250 μL OPTI-MEM培養基和2 μg質粒DNA，輕輕混勻。室溫下孵育5 min后，混勻以上2種復合物，室溫孵育20 min。最后將此復合物加入到含有1.5 mL OPTI-MEM的6孔板中，細胞培養4～6 h后，換無血清ECM培養基繼續培養。

4.3 Real-time RT-PCR檢測HUVECs中Orai3 mRNA的表達 引物由友名生物技術有限公司設計合成。Orai3上游引物5′-GAG AGC TTG TGG GAC CTT CAG TG-3′，下游引物 5′-TAA ACC AAC AAT TGG CTG CCT TC-3′。β-actin 上游引物 5′-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3′，下游引物 5′-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3′。用 Trizol法抽提細胞RNA，紫外分光光度儀分別在260 nm和280 nm波長下檢測計算提取的總RNA濃度及純度。然后按逆轉錄試劑盒(TaKaRa)將RNA逆轉為cDNA，以此為模板以β-actin為內參照，用real-time RT-PCR試劑盒對mRNA進行多聚酶聯反應，反應體系為25 μL，其中 SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，樣品cDNA 2.0 μL，滅菌蒸餾水 9.5 μL。反應條件為預變性95℃ 30 s;PCR反應(95℃ 5 s、60℃ 20 s)，40個循環。隨之由電腦自動分析系統進行定量分析，每組實驗重復4次。

4.4 免疫印跡法檢測HUVECs中Orai3的蛋白表達及干擾效率 各轉染組轉染48 h后，用G418進行穩篩，7 d后棄去培養基，用預冷的PBS沖洗細胞3次，在冰上按1∶100的比例加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液100 μL，用細胞刮刮下貼壁細胞，將黏稠狀細胞裂解產物收集于離心管中。冰中靜置60 min，12 000 r/min、4℃ 離心15 min。取上清到另一離心管，棄去沉淀。取5 μL上清用于 BCA試劑測定蛋白質濃度并標化，以β-actin為內參照。將蛋白樣品加入加樣緩沖液，沸水煮10 min，10 000 r/min離心5 min后上樣。SDS-PAGE電泳分離蛋白，選用硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜進行濕轉，用5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，分別加入抗 Orai3抗體(1∶1 000)，抗 β-actin抗體(1∶800)置于 4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜4次，加入Ⅱ抗(1∶5 000)，37℃搖床上孵育1 h。TBST洗3次。用ECL化學發光試劑進行顯色，顯影、定影，獲得實驗結果，重復3次。

4.5 HUVECs中Ca2+濃度測定 參照文獻［6］將第2代或第3代HUVECs接種于放有圓形玻片的培養皿中，待細胞達80%融合時進行轉染，轉染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，將1 μL濃度為1 mmol/L的 Fura-2/AM 與499 μL含2 mmol/L含鈣液混合后加入灌流槽中，37℃孵育細胞30 min。沖洗3～5遍后用含鈣液去酯化20 min。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上，利用340 nm與380 nm波長的激發光激發Ca2+熒光探針Fura-2/AM發射熒光，用CCD拍攝熒光的動態變化，通過340 nm和380 nm的熒光強度比值的變化(即Δratio)反映［Ca2+］i，每組實驗重復3次。

4.6 HUVECs中NO含量的檢測 參照文獻［6］，將第2代或第3代HUVECs接種于放有圓形玻片的培養皿中，待細胞達80%左右融合時進行轉染，轉染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，按1∶2 000比例加入DAF-FM DA熒光探針稀釋液稀釋DAF-FM DA，37℃孵育細胞20 min后，用2 mmol/L含鈣液沖洗3次后將灌流槽放于熒光顯微鏡上，用495 nm激發波長，515 nm發射波長，實時檢測2 mmol/L精胺刺激前后熒光的強弱變化，并通過IPA Software進行分析。NO相對熒光強度計算公式如下:NO含量=［測定孔曲線最高相對熒光強度(relative fluorescence unit，RFU)-最低RFU］-(空白孔曲線最高RFU-最低RFU)，每組實驗重復3次。

5 統計學處理

數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17.0統計軟件分析，多組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，有顯著差異者兩組間均數比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 激光共聚焦顯微鏡下觀察shRNA成功轉染HUVECs

細胞轉染Cy3標記的shOrai3后，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見成功轉染的細胞內發出紅色熒光，可反映轉染效率。轉染48 h后加入G418穩篩后，可獲取90%以上的陽性克隆細胞，見圖1。

Figure 1.Cy3-labelled shOrai3-transfected HUVECs(×20).A:the HUVECs profile under nature light;B:Cy3-labelled red fluorescence in HUVECs;C:merged image.Scale bar=50 μm.圖1 Cy3標記的shOrai3轉染進入細胞

2 Real-time RT-PCR檢測HUVECs中Orai3 mRNA的表達及shOrai 3的干擾效率

同一代HUVECs分為3組:即空白對照組(control組)、空質粒組(vehicle組)和實驗組(shOrai3-75、shOrai3-76和shOrai3-77組)。各轉染組分別轉染48 h后用G418進行穩篩7 d后提取總mRNA，采用real-time RT-PCR檢測Orai3 mRNA的表達。結果顯示:轉染各組與control組相比，可見vehicle組mRNA表達無明顯變化(P＞0.05)，其余各轉染組mRNA的表達均有降低，尤其是shOrai3-77組中Orai3 mRNA表達顯著降低(抑制率為84.5%，P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Expression of Orai3 mRNA in HUVECs and interference efficiency of shOrai3.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle group.圖2 各轉染組HUVECs中Orai3 mRNA的表達及shOrai3的干擾效率

3 免疫印跡技術檢測Orai3的蛋白表達及shOrai3的干擾效率

提取轉染48 h、用 G418(200 mg/L)進行篩選7 d后HUVECs的總蛋白，轉染各組與control組相比，可見 vehicle組的 Orai3蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，其余各轉染組蛋白的表達均有降低，尤其是shOrai3-77組中Orai3的蛋白表達顯著降低(抑制率為70.68%，P＜0.05)，見圖3。

4 不同處理因素對HUVECs中［Ca2+］i和NO生成的影響

4.1 Orai3基因沉默使CaR激動劑精胺誘導的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 選取干擾效率最高的shOrai3-77組為特異性質粒轉染組即實驗組(即精胺+Ca2++shOrai3-77組)，另設未轉染組即空白對照組(control組，即精胺+Ca2+組)和空質粒組(vehicle-Orai3組，即精胺 +Ca2++vehicle-Orai3組)，將3組細胞接種于圓形玻片上，待HUVECs生長融合至80%左右時進行轉染，繼續培養48 h后將玻片取出，放入灌流槽中測定加精胺刺激后［Ca2+］iΔratio值和NO熒光強度值的變化。與空白對照組及空質粒組相比，實驗組［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值明顯降低(P＜0.05)，而空質粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經SOC和ROC介導的［Ca2+］i和NO生成減少，見圖 4、5。

Figure 3.Expression of Orai3 protein in HUVECs and inhibitory efficiency of shOrai3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle group.圖3 各轉染組HUVECs中Orai3蛋白的表達及shOrai3的抑制效率

Figure 4.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after CaR agonist spermine treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖4 CaR激動劑精胺刺激HUVECs后各轉染組中Ca2+熒光強度的動態變化

4.2 Orai3基因沉默使ROC模擬劑TPA+CaR負性變構調節劑Calhex 231誘導的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細胞分為實驗組(即Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即 Calhex 231+TPA+精胺 +Ca2+組)和空質粒組(vehicle-Orai3組，即 Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細胞轉染48 h后，與空白對照組及空質粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值明顯降低(P＜0.05)，而空質粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經ROC介導的［Ca2+］i和 NO 生成減少，見圖6、7。

4.3 Orai3基因沉默使PKC抑制劑Ro31-8220介導的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細胞分為實驗組(即Ro31-8220+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即Ro31-8220+精胺+Ca2+組)和空質粒組(vehicle-Orai3組，即Ro31-8220+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細胞轉染48 h后，與空白對照組及空質粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和 NO凈熒光強度值明顯降低(P＜0.05)。而空質粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和 NO凈熒光強度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經SOC介導的［Ca2+］i和NO生成減少，見圖8、9。

Figure 5.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖5 CaR激動劑精胺刺激HUVECs后各轉染組中NO熒光強度的動態變化

Figure 6.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after CaR negative allosteric modulator Calhex 231 plus ROC analogue TPA treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖6 ROC模擬劑TPA+CaR負性變構調節劑Calhex 231刺激HUVECs后各轉染組中Ca2+熒光強度的動態變化

Figure 7.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR negative allosteric modulator Calhex 231 plus ROC analogue TPA treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖7 ROC模擬劑TPA+CaR負性變構調節劑Calhex 231刺激HUVECs后各轉染組中NO熒光強度的動態變化

4.4 Orai3基因沉默使經典型PKCs和PKCμ抑制劑 Go6967介導的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細胞分為實驗組(即Go6976+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即Go6976+精胺 +Ca2+組)和空質粒組(vehicle-Orai3組，即Go6976+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細胞轉染48 h后，與空白對照組及空質粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值明顯降低(P＜0.05)，而空質粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經SOC介導的［Ca2+］i和 NO 生成減少，見圖10、11。

討 論

Ca2+是細胞內最普遍和最重要的信號轉導成分，在細胞內轉導信息，并且調控多種生命過程，如細胞的收縮、增殖、分化與凋亡等［7］。無論在細胞內或細胞外執行功能，Ca2+必須首先達到或維持一定濃度，并且在細胞內外維持一定的濃度差。各種信號分子、電壓依賴性鈣通道、ROC、SOC等在［Ca2+］i的調節方面發揮重要作用，包括由CaR介導的細胞內鈣庫釋放和由各類通道介導的Ca2+內流兩部分。CaR調節細胞內鈣庫釋放使［Ca2+］i升高，其速度快但是維持時間短，而細胞外Ca2+內流則可使［Ca2+］i持續升高，可以調節長期細胞效應，如細胞生長、分化及細胞內NO的生成等，因此細胞外Ca2+內流在細胞內轉導信息方面更為重要［8］。以往研究大多只關注細胞內鈣釋放對［Ca2+］i及 NO生成的影響［6］，而細胞內鈣池持續釋放有賴于外Ca2+內流對細胞內鈣池的重新填充，且本課題組前期研究發現在HUVECs中CaR激活引發持續Ca2+內流是NO生成重要條件［4-5］，但參與Ca2+內流關鍵分子組件尚不清楚。

Figure 8.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after PKA inhibitor Ro31-8220 treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖8 PKC抑制劑Ro31-8220刺激HUVECs后各轉染組中Ca2+熒光強度的動態變化

Figure 9.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after PKA inhibitor Ro31-8220 treatment in different transfected HUVEC.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3group.圖9 PKC抑制劑Ro31-8220刺激HUVECs后各轉染組中NO熒光強度的動態變化

Figure 10.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after PKCs and PKCμ inhibitor treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖10 經典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967刺激HUVECs后各轉染組中Ca2+熒光強度的動態變化

Figure 11.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after PKCs and PKCμ inhibitor treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖11 經典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967刺激HUVECs后各轉染組中NO熒光強度的動態變化

有研究表明在HEK293細胞株、T淋巴細胞和成纖維細胞中都有Orai1、Orai2和 Orai3 mRNA表達，其中，Orai1是介導SOC的主要分子組成部分，3種Orai以同源二聚體、同源多聚體和異源多聚體形式存在于細胞膜上［9］。此外，雖然Orai1、Orai2和Orai3在序列上高度同源，但它們所表現出的功能特點有著很明顯的區別。Lis等［10］采用 Orai2和 Orai3與STIM1共表達的方法發現，Orai2和Orai3與STIM1共同異位表達時均能形成Ca2+通道并且顯示出類似于Orai1與STIM1的共表達產生的Ca2+釋放激活的鈣電流的電生理特性。然而兩者在其激活和失活的動力學、對一價離子的滲透和對SOC抑制劑2-氨乙氧基二苯基硼酸鹽(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)的反應上都有所不同，50 μmol/L 2-APB能夠抑制Orai1與 STIM1介導的 Ca2+電流，但能激活Orai3與 STIM1介導的 Ca2+電流。Faouzi等［11］研究表明乳腺癌組織中Orai3表達上調，并通過絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路激活c-myc基因，在乳腺癌細胞增殖及細胞周期進展調控中起著重要作用。Motiani等［12］研究顯示Orai3的高表達可促進氧化應激介導的效應T淋巴細胞增殖;與此同時有學者指出Orai3參與了血管平滑肌重塑以及血管損傷所致的新生內膜增生［13］。

我們前期研究發現HUVECs中CaR為功能性表達，并證實CaR在介導Ca2+內流、eNOS活性和NO生成中起著重要作用［14］，且SOC與ROC是以協同方式參與CaR介導的Ca2+內流及NO生成。而鈣通道相關蛋白Orai3是否為其關鍵分子組件尚不清楚。本研究首先采用脂質體法將設計好的shRNA包裹轉染到HUVECs中，將篩選出來的抑制效率最高的shRNA轉染HUVECs，在保證沉默Orai3基因有效抑制Orai3表達前提下，以精胺與原代培養HUVECs共孵育激活CaR為細胞模型，首先證實了在HUVECs中沉默Orai3后對 CaR介導的［Ca2+］i升高和 NO生成均有抑制作用，此抑制效應由shRNA特異抑制Orai3基因表達所介導。而后又以ROC模擬劑TPA+CaR負性變構調節劑 Calhex 231、PKC抑制劑Ro31-8220及經典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967共孵育HUVECs為細胞模型，通過分別激活SOC或ROC最終證明在精胺刺激激活CaR介導［Ca2+］i和NO的生成過程中，Orai3既作為SOC的關鍵組件，又作為ROC的關鍵組件參與了CaR介導Ca2+內流及NO生成。

綜上所述，本研究以HUVECs為研究對象，通過RNAi沉默 HUVECs中Orai3的表達，成功構建了Orai3基因的shOrai3，并為后續相關Orai3功能的研究打下了基礎，亦證明了Orai3為CaR經SOC、ROC途徑介導鈣內流和NO生成的關鍵組件之一。基于目前文獻報道的CaR在調節血管張力、心肌肥厚、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷等心血管生理和病理生理過程中的重要作用，無疑本研究結論將為進一步闡明CaR導致鈣超載和血管內皮功能障礙及在相關心血管疾病發病中作用和機制提供重要理論基礎，并為其防治提供新靶標。

(致 謝:衷心感謝華中科技大學同濟醫學院病理生理學系/衛生部呼吸疾病重點實驗室提供實驗條件和技術指導。)

［1］ Ji W，Xu P，Li Z，et al.Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(36):13668-13673.

［2］ Mercer JC，Dehaven WI，Smyth JT，et al.Large storeoperated calcium selective currents due to co-expression of Orai1 or Orai2 with the intracellular calcium sensor，Stim1［J］.J Biol Chem，2006，282(34):24979-24990.

［3］ DeHaven WI，Smyth JT，Boyles RR，et al.Calcium inhibition and calcium potentiation of Orai1，Orai2，and ORAI3 calcium release-activated calcium channels［J］.J Biol Chem，2007，282(24):17548-17556.

［4］ 王振煥，胡清華，鐘 華，等.小凹蛋白-1在臍靜脈內皮細胞CaR介導NO生成中的作用和機制［J］.中國病理生理雜志，2011，27(5):934-938.

［5］ 王振煥，胡清華，鐘 華，等.小凹蛋白-1下調人臍靜脈內皮細胞外鈣敏感受體介導的鈣內流［J］.生理學報，2011，63(1):39-47.

［6］ Ziegelstein RC，Xiong Y，He C，et al.Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342(1):153-163.

［7］ Smyth JT，Dehaven WI，Jones BF，et al.Emerging perspectives in store-operated Ca2+entry:roles of Oral，Stim and TRP［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1763(11):1147-1160.

［8］ Carafoli E.Calcium signaling:a tale for all seasons［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(3):1115-1122.

［9］ Gwack Y，Srikanth S，Feske S，et al.Biochemical and functional characterization of Orai proteins［J］.J Biol Chem，2007，282(22):16232-16243.

［10］ Lis A，Peinelt C，Beck A，et al.CRACM1，CRACM2，and CRACM3 are store-operated Ca2+channels with distinct functional properties［J］.Curr Biol，2007，17(9):794-800.

［11］Faouzi M，Kischel P，Hague F，et al.ORAI3 silencing alters cell proliferation and cell cycle progression via c-myc pathway in breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Acta，2013，1833(3):752-760.

［12］ Motiani RK，Stolwijk JA，Newton RL，et al.Emerging role of Orai3 in pathopthysiology［J］.Channels(Austin)，2013，7(5).［Epub ahead of print］

［13］González-Cobos JC，Zhang X，Zhang W，et al.Store-independent Orai1/3 channels activated by intracrine leukotriene C4:role in neointimal hyperplasia［J］.Circ Res，2013，112(7):1013-1025.

［14］梁 霄，羅小林，鐘 華，等.小干擾RNA沉默細胞外鈣敏感受體抑制人臍靜脈內皮細胞鈣內流和NO生成［J］.生理學報，2012，64(3):289-295.