環孢素對癲癇大鼠海馬氧化應激及線粒體能量代謝的影響*

王勝軍， 薄 寧， 薄其玉， 趙秀鶴， 曹麗麗， 遲兆富

環孢素(cyclosporin;或環孢素A，cyclosporin A，CsA)可抑制T細胞的活化從而抑制免疫系統的活性，被廣泛用于器官移植排斥的治療。環孢素還可與線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的親環蛋白D結合，阻斷線粒體膜通透性轉換(mitochondrial permeability transition，MPT)，調節線粒體功能及細胞存亡［1-2］。線粒體是細胞的“動力工廠”，線粒體呼吸鏈復合物(mi-tochondrial respiratory chain complexes)通過氧化磷酸化以ATP的形式為細胞提供能量。大量研究表明，癇性發作可使線粒體結構受損、能量代謝障礙，而線粒體結構和功能異常可加重神經元損傷，引起神經元興奮性增高［3-5］。

癲癇發作尤其是癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)時腦組織產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，作用于線粒體，產生毒性作用［6］。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質過氧化的終產物，能反映組織自由基的水平;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是機體內重要的自由基清除酶，對ROS有清除作用。ROS可造成mPTP開放，導致線粒體功能障礙，因此，抑制ROS產生可有效減輕神經元的損傷［7］。

研究發現，環孢素可減少癲癇中神經元損傷并減少癲癇發作頻率［8］，但環孢素是否參與調節癲癇大鼠海馬神經元氧化應激及線粒體能量代謝仍未見報道。本文利用匹魯卡品(pilocarpine)誘導的癲癇持續狀態動物模型來評價環孢素對癲癇大鼠海馬氧化應激和線粒體損傷的調節作用及分子機制。

材料和方法

1 材料

雄性Wistar大鼠48只，6～8周齡，體重(250±50)g，由山東大學實驗動物中心提供。環孢素、匹魯卡品、丙稀酰胺、泛醌、魚藤酮、抗霉素A、十二烷基麥芽苷、細胞色素 C和泛醇2購自 Sigma。MDA、SOD和ATP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 動物模型的制作與分組

48只大鼠隨機分為空白對照組(control組)、親環素對照組(CsA組)、匹魯卡品致癲癇持續狀態組(SE組)和環孢素干預組(SE+CsA組)，每組12只。SE組大鼠首先皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，用以拮抗匹魯卡品的外周膽堿能反應，30 min后腹腔注射匹魯卡品340 mg/kg，觀察大鼠的行為學變化，達到Racine 4～5級標準的大鼠被認為癲癇模型制作成功，大鼠癲癇發作持續1 h后給予腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發作。SE+CsA組大鼠為匹魯卡品注射前30 min腹腔注射環孢素(10 mg/kg)。CsA組大鼠僅注射環孢素而不注射匹魯卡品。對照組大鼠注射等量生理鹽水代替匹魯卡品，各組動物分別在腹腔注射24 h后處死。

3 方法

3.1 腦組織樣本制備 大鼠迅速斷頭取腦，分離海馬，冰浴中研磨，600×g離心15 min，取上清液為海馬組織成分。海馬組織加入裂解液，冰浴中充分研磨，800×g離心5 min，取上清液12 000 ×g離心10 min，沉淀為線粒體成分，用保存液懸浮沉淀，采用Bradford法檢測線粒體蛋白含量。

3.2 線粒體膜通透性轉換的檢測 線粒體膜通透性轉換增大時線粒體膜內外滲透失衡，導致吸光度明顯減少。線粒體蛋白加入測定液(230 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，3 mmol/L HEPES緩沖液，25℃，pH 7.4)，在540 nm波長處用分光光度計測定吸光度值。

3.3 MDA和SOD的檢測 利用MDA可與硫代巴比妥酸縮合，在530 nm處有最大吸收峰，檢測其活性。利用超氧陰離子自由基與氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑作用后在550 nm處有最大吸收峰檢測SOD活性，按照試劑盒說明書進行操作。

3.4 ATP含量的檢測 利用肌酸激酶催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，用磷鉬酸比色法檢測海馬組織中ATP含量，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

3.5 線粒體呼吸鏈復合物I、III活性的檢測 參照Gao等［5］報道的方法，將線粒體成分溶于分析介質，應用分光光度計檢測活性。線粒體呼吸鏈復合物I活性檢測:溶于介質的線粒體反復凍融3次，加入BSA(2.5 g/L)、抗霉素 A(2 mg/L)、NADH(0.13 mmol/L)、氰化鉀(2 mmol/L)和泛醌(50 μmol/L)，混勻后在340 nm處檢測吸光度。線粒體呼吸鏈復合物III活性檢測:溶于分析介質的線粒體成分加入細胞色素 C(15 μmol/L)、魚藤酮(2 mg/L)、十二烷基麥芽苷(0.6 mmol/L)和泛醇 2(35 μmol/L)，在550 nm處檢測吸光度的變化。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗。統計分析采用SPSS 13.0軟件，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 環孢素可抑制癲癇大鼠海馬組織線粒體通透性轉變

SE組大鼠海馬組織的MPT值明顯高于對照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的MPT值顯著低于SE組(P＜0.05);CsA對照組與正常對照組MPT值之間的差異無統計學意義，見表1。

表1 環孢素對癲癇大鼠海馬組織線粒體膜通透性轉換及呼吸鏈復合物I、III活性的調節Table 1.Effect of cyclosporin A(CsA)on mitochondrial permeability transition(MPT)，mitochondrial respiratory chain complex I and III in rat hippocampus after status epilepticus(SE)(Mean±SD.n=6)

2 環孢素能減少癲癇大鼠海馬組織的脂質過氧化水平并提高SOD活性

SE組大鼠海馬組織的MDA明顯高于對照組，SOD明顯低于對照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的MDA含量顯著低于SE組，SOD活性顯著高于SE組(P＜0.05);CsA對照組與正常對照組之間的 MDA含量和 SOD活性無統計學差異，見表2。

3 環孢素增加癲癇大鼠海馬組織的ATP含量

SE組大鼠海馬組織的ATP含量明顯高于對照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的ATP含量明顯低于SE組(P＜0.05);CsA對照組與正常對照組的ATP含量值無統計學差異，見表2。

表2 環孢素對癲癇大鼠海馬組織MDA、SOD和ATP水平的調節Table 2.Effect of cyclosporin A(CsA)on MDA，SOD and ATP in rat hippocampus after status epilepticus(SE)(Mean±SD.n=6)

4 環孢素調節癲癇大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈復合物的活性

SE組大鼠海馬組織呼吸鏈復合物I的活性低于對照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織呼吸鏈復合物I的活性高于SE組(P＜0.05);CsA對照組與正常對照組的呼吸鏈復合物I活性差異無統計學意義。各實驗組與對照組間的呼吸鏈復合物III活性差異無統計學意義，見表1。

討 論

mPTP是一種橫跨于線粒體外膜和內膜之間的跨膜多蛋白孔道，其分子組成尚未完全清楚，生理狀態的mPTP能通過小于1 500 kD分子量的非特異性物質［2，9］。在受到特定刺激后mPTP開放，使大分子質量物質非選擇性地自由通過線粒體膜，造成線粒體內離子平衡紊亂、線粒體腫脹、氧化磷酸化解耦聯、ATP水平下降，同時還可引起線粒體膜電位去極化，使細胞色素C、凋亡誘導因子等凋亡活性物質釋放入胞質，誘導細胞死亡。另外，線粒體呼吸功能紊亂，組成線粒體抗氧化防御系統的還原型煙酰胺二核苷酸流失，使線粒體產生大量的ROS，進一步加重線粒體的損傷［9］。mPTP開放受親環蛋白D、電壓依賴性離子通道與腺嘌呤核苷酸轉位酶的調節，環孢素可通過結合親環蛋白D來抑制mPTP開放，從而引起膜通透性的轉變［1，9］。本研究利用分光光度法檢測線粒體滲透性轉換能力的變化，間接反映mPTP的開放情況。本研究結果表明，匹魯卡品誘發的大鼠癲癇持續狀態可導致海馬線粒體膜通透性轉換孔的大量開放，表現為線粒體通透性轉變值減小，而環孢素干預后可使神經元線粒體通透性轉變值仍保持較高的水平，提示它可明顯抑制mPTP的開放。

癲癇發作時產生的大量谷氨酸，可使神經元鈣離子濃度增加，順著電化學梯度進入線粒體內，導致線粒體內鈣超載，從而誘導mPTP開放。此外，癲癇造成的氧化應激也是調節mPTP開放的一個重要因素。雖然腦組織存在多種的抗氧化防御系統，但癲癇發作時可產生大量ROS［6］。ROS一方面攻擊神經元核DNA，激活核酸修復酶聚(ADP核糖)聚合酶，加重細胞能量消耗及激活線粒體凋亡誘導蛋白和炎癥因子［10-11］。另一方面ROS可以通過氧化mPTP上的硫醇而觸發mPTP開放，損傷線粒體DNA導致呼吸鏈復合物亞基表達的改變，影響線粒體的能量代謝［12］。研究發現，線粒體抗氧化酶 MnSOD部分缺失可增加腦的興奮性，MnSOD表達下調的轉基因小鼠癲癇的發生率明顯增加，提示線粒體的氧化應激可能是癲癇形成的重要機制［13］。ROS可造成線粒體結構數目、能量代謝及生物合成異常，導致神經元功能障礙，促進癲癇的形成與反復發作［5，7-8］。線粒體既是ROS易損傷的細胞器，也是ROS產生的重要場所，ROS可誘導線粒體mPTP開放，進而加重線粒體腫脹及線粒體呼吸鏈功能，促進ROS的產生［6，9］。本研究顯示，癲癇發作后海馬組織中脂質過氧化產物MDA含量明顯升高，同時自由基清除酶SOD的活性明顯降低，這與以往的報道一致［7，14］。本研究發現，環孢素可明顯抑制癲癇發作造成的海馬組織的氧化損傷，提示減少mPTP開放可有效減少癲癇發作誘發的ROS增加，阻斷ROS產生與線粒體損傷間的惡性循環。

線粒體呼吸鏈復合物位于線粒體內膜上，由5個復合物組成，分別為NADH氧化還原酶(復合物I)、琥珀酸氧化還原酶(復合物II)、細胞色素還原酶(復合物III)、細胞色素C氧化酶(復合物IV)和ATP合成酶(復合物 V)［3］。線粒體呼吸鏈復合物 I、III是線粒體產生ROS的重要部位［3，15］。近些年來的研究表明，神經元線粒體的功能損傷影響神經元的生存及可塑性的改變，與癲癇發生及反復發作的維持密切相關［3，5-7］。本研究發現，線粒體呼吸鏈復合物I在癲癇發作后活性明顯下降，呼吸鏈復合物III活性無明顯變化，環孢素可明顯減輕SE對神經元線粒體呼吸鏈復合物I活性的損害。我們以前的研究還發現，線粒體呼吸鏈復合物IV活性在匹羅卡品誘導的癲癇模型急性期表現為代償性增高，而在慢性期則活性下降，而且線粒體基因組參與編碼的復合物亞基表達明顯下降，提示線粒體DNA損傷可能是慢性期呼吸鏈復合物活性降低及慢性癲癇形成的重要原因之一［3，5-6］。線粒體DNA的保護機制和修復機制均不完善，比核DNA更易受到自由基的攻擊，造成線粒體DNA的降解，使每個線粒體中DNA的拷貝數下降，線粒體編碼的呼吸鏈亞單位的合成受損，導致線粒體功能的嚴重破壞［13］。

總之，環孢素可減輕癲癇持續狀態大鼠海馬氧化應激，保護線粒體呼吸鏈功能。對此進行深入研究有助于我們對癲癇致神經元損傷及癲癇反復發作形成機制的理解。

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