電針豐隆穴對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達的影響

王瓊,田佳玉,肖穎,張紅星

(武漢市中西醫結合醫院,武漢 430022)

高脂血癥是由于體內脂質代謝紊亂而形成的血漿脂質中一種或多種成分的濃度超過正常高限的一種病癥。它是導致動脈粥樣硬化癥的主要危險因素,與高血壓、冠心病、腦血管疾病等密切相關。近年來,隨著高脂血癥發病率的升高,動脈粥樣硬化的危險性也相應增加。因此,有必要積極預防和及時控制血脂水平[1]。臨床上,藥物性降脂治療較為常用且效果肯定,但降脂藥物對肝腎功能有損害,因此有其局限性[2]。大量報道均已證實[3-5],針灸療法以方法多、操作簡易、無毒副反應等特點,已應用于高脂血癥的臨床治療,且取得一定成效[6-8]。本研究通過觀察電針高脂血癥大鼠的豐隆穴,對其腹腔巨噬細胞表面抗原CD11b、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達的影響,明確電針在治療高脂血癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠40只,雄性,體重180～200 g,由湖北省動物實驗中心提供,動物合格證號為[SCXK(鄂)2008-0004]。根據隨機數字表分為正常對照組、高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組,每組8只大鼠。

1.2 主要藥品與儀器

流式細胞儀(美國ABI公司),抗大鼠CD11b-PERCP單克隆抗體(美國eBioscience公司),抗大鼠ICAM-1-FITC單克隆抗體(美國eBioscience公司),1640培養液,PBS緩沖液(美國 HyClone公司),Ionomycin,莫能霉素(美國 ENZO公司),PMA,多聚甲醛(美國 SIGMA公司),皂苷(美國 Amresco公司),0.1%BSA(瑞士 Roche公司),LH202H型韓氏穴位神經刺激儀(北京華威有限公司),0.25 mm×25 mm不銹鋼針灸針。

1.3 動物造模

正常對照組大鼠用普通大鼠飼料自然喂養,高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組大鼠用高脂飼料[9](豬油 10%,蛋黃粉5%,膽固醇1%,丙基硫氧嘧啶0.2%,脫氧膽酸鈉0.5%,蔗糖 5%,基礎飼料 78.3%)喂養,其中高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組大鼠用高脂飼料喂養28 d后,換用普通飼料,同時對高脂飼料治療組及高脂＋普通飼料治療組大鼠進行電針豐隆穴治療。

1.4 治療方法

取穴參照《實驗針灸學》[10],選取雙側豐隆穴,模擬人體經穴定位。豐隆穴在大鼠膝關節外側后三里下1 mm,腓骨小頭下約5 mm處。用0.25 mm×25 mm針灸針,對豐隆穴直刺 7 mm,快速捻轉至針下有沉澀感后,接韓式穴位神經刺激儀,等幅疏密波,頻率為2/100 Hz,電流強度2 mA,以動物肢體微顫為度,每次治療時間為30 min,每天1次,連續治療28 d。常規溫度、濕度及統一飲水喂養。

1.5 血脂的檢測

所有SD大鼠經頸動脈用肝素鈉試管采血4～5 mL,上、下緩慢顛倒3次混勻。4℃離心(3000 r/min)10 min,取上層血清2 mL,置入EP管中,﹣20℃冰箱保存。送至我院檢驗科,根據各指標試劑盒說明書,采用Olympus AU2700型全自動生化分析儀,檢測血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。

1.6 流式細胞儀檢測

檢測大鼠腹腔巨噬細胞表面抗原 CD11b、細胞間黏附分子(ICAM-1)的分子表達水平。

1.6.1 提取大鼠腹腔巨噬細胞

參照蘭青等[11]的方法來提取大鼠腹腔巨噬細胞,具體步驟如下。引頸殺死大鼠,手提尾鼠將全鼠浸入70%乙醇中浸泡5 min后,再將大鼠倒立提起,從腹腔一側近腹股溝處注入1640培養液30～50 mL,仰臥平放并用手指輕柔大鼠腹部3 min,靜置5 min后,在超凈工作臺上打開大鼠腹腔,觀察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時,用無菌滴管吸取腹腔液約 10 mL,1200 r/min離心8 min。去上清,留下離心管底部乳白色沉淀,1640培養液調整細胞至所需濃度。

1.6.2 固定及染色

將分離后的巨噬細胞液加至96孔U型板,0.2 mL 1×107/mL,加入PMA(5 ng/mL)、ionomycin (500 ng/mL)和莫能霉素(Monensin)(終濃度為2 μM)置37℃、5%CO2孵箱培養4 h后收集細胞,PBS洗1次,調整細胞濃度1×107/mL,50 μL細胞加入抗 CD11b抗體,4℃孵育30 min,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定4℃,30 min。PBS洗2次,第2次用含0.1%的皂苷,0.1%BSA的PBS洗細胞,調整細胞濃度 1×107/mL,50 μL細胞加入 ICAM-1抗體,4℃孵育 30 min, PBS洗 2次,PBS重懸細胞至0.3 mL,流式細胞儀檢測。

1.6.3 設置流式檢測對照

①空白孔 2×105/0.3mL細胞;②2×105/0.3mL細胞加CD11b抗體;③2×105/0.3mL細胞加ICAM-1抗體;④2×105/0.3mL細胞加CD11b抗體＋ICAM-1二標。

1.7 統計學方法

采用 SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析,繼以 LSD檢驗,實驗結果以均數±標準差表示,CD11b與ICAM-1相關性使用相關性分析,以P＜0.05為具有統計學意義,一致性檢驗采用Bland-A ltman分析[12]。

2 結果

2.1 電針豐隆穴對高脂血癥大鼠血脂水平的影響

由表1可以看出,與正常對照組相比,高脂飼料組大鼠血漿 TC、LDL-C明顯上升(P＜0.01),而 TG和HDL-C變化不明顯(P＞0.05);高脂＋普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組比較明顯下降(P＜0.01),較正常對照組仍明顯升高(P＜0.01);高脂飼料治療組與高脂飼料組比較,TC和LDL-C明顯下降(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組大鼠TC、LDL-C與高脂＋普通飼料組比較,明顯降低(P＜0.01),TG和HDL-C變化不明顯(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血脂變化 (±s,mmol/L)

表1 各組大鼠血脂變化 (±s,mmol/L)

注:與正常對照組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與高脂飼料組比較3)P＜0.01;與高脂＋普通飼料組比較4)P＜0.01

組別 n TC TG HDL-C LDL-C正常對照組 8 1.60±0.37 0.58±0.21 0.67±0.08 0.21±0.07高脂飼料組 8 10.91±3.012) 0.51±0.11 0.81±0.21 5.43±1.012)高脂飼料治療組 8 5.16±0.822)3) 0.57±0.16 0.61±0.18 1.29±0.311)3)高脂＋普通飼料組 8 6.79±1.052)3) 0.67±0.19 0.62±0.14 2.31±0.652)3)高脂＋普通飼料治療組 8 3.16±0.473)4) 0.52±0.17 0.72±0.18 0.69±0.453)4)

2.2 電針豐隆對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細胞CD11b、ICAM-1的影響

由表 2可以看出,高脂飼料組大鼠巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達率較正常對照組明顯上升(P＜0.01),高脂＋普通飼料組大鼠巨噬細胞 CD11b、ICAM-1表達率較高脂飼料組明顯下降(P＜0.05),較正常對照組仍明顯上升(P＜0.01),高脂飼料治療組與高脂飼料組比較,CD11b、ICAM-1表達率明顯下降(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組與高脂＋普通飼料組比較,CD11b、ICAM-1表達率明顯降低(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較,CD11b、ICAM-1表達率明顯降低(P＜0.01)。

表2 各組大鼠巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達率的變化(±s)

表2 各組大鼠巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達率的變化(±s)

注:與正常對照組比較 1)P＜0.05,2)P＜0.01;與高脂飼料組比較 3)P＜0.05,4)P＜0.01;與高脂＋普通飼料組比較5)P＜0.05,6)P＜0.01

組別 n CD11b(%)ICAM-1(%)正常對照組 8 16.29±1.73 2.04±0.63高脂飼料組 8 65.14±3.742) 18.21±2.442)高脂＋普通飼料組 8 48.73±2.272)3) 11.99±1.262)3)高脂飼料治療組 8 36.91±2.542)4)6) 5.80±1.244)6)高脂＋普通飼料治療組 8 26.49±2.121)4)6) 3.93±0.351)6)

2.3 CD11b與ICAM-1相關性分析

直線相關分析結果表明,CD11b與ICAM-1水平呈顯著正相關(r=0.947,P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 CD11b表達與ICAM-1表達的關系

3 討論

高脂血癥在中醫學典籍中并無相關記載,《內經》對膏脂的正常功能及代謝異常均有描述:“五谷之津液,和合而為膏者,內滲于骨空,補益腦髓,而下流于陰股。”“高粱之變,足生大丁。”近年來,眾多醫家將其歸于“痰證”、“瘀證”范圍。中醫學理論認為,高脂血癥的產生與肝、脾、腎三臟關系最為密切,其病機為飲食肥甘厚味,損傷脾胃,同時肝膽疏泄功能不暢,不能泌輸精液而引起脾之消谷、運化功能失調,轉化為痰濁;或腎之陰陽俱虛,相火妄動,致肝陽上亢,甚則化火,木旺則乘土,使脾胃輸布功能失調,濕熱郁結,痰濁、瘀血內生而阻塞血脈。其治療以化痰降濁、活血化瘀治其標,健脾益氣,強本清源治其本。

豐隆穴是足陽明胃經之絡穴,通脾胃二經,既可健胃,又可運脾,在調理脾胃功能、調節血脂方面具有顯著的療效,具有祛痰、和胃降逆和健脾益胃的作用,《玉龍歌》載“痰多宜向豐隆尋”,為化痰首選穴。中醫學的“痰”與自由基代謝異常有關,現代研究顯示[13],豐隆穴的化痰作用不僅與調節血脂有關,而且能改善機體的自由基代謝。

膽固醇由食物及體內生物所合成,對機體組織來說,維持膽固醇的供給,確保其代謝平衡是及其重要的。若機體總膽固醇太高,超過所合成和生物膜、膽汁酸及類固醇激素等物質的需要時,膽固醇則會沉積于動脈內皮下的巨噬細胞中,引起內皮下變形,從而致使血小板在動脈內壁集聚。如果同時還伴動脈壁損傷及膽固醇轉運障礙,則會在動脈內膜形成脂斑,從而導致動脈管腔變窄,引發動脈粥樣硬化的發生。血中膽固醇主要由LDL-C攜帶運輸,通過細胞膜上LDL-C的受體介導的內吞作用進入細胞。當細胞內膽固醇過高時,可抑制LDL-C受體的補充,從而減少由血中攝取的膽固醇。本實驗結果顯示,電針豐隆穴治療高脂血癥大鼠后,大鼠血漿中TC、LDL-C明顯降低。說明了針刺豐隆穴降脂的效果是十分顯著的,從而能起到一定的預防動脈粥樣硬化的作用。此外,高脂＋普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C較高脂飼料組明顯降低,說明了控制高脂飲食對高脂血癥的轉歸具有良性作用。

高脂血癥不僅是動脈粥樣硬化的促發因素,而且貫穿其發生、發展的過程當中,和內皮功能改變、白細胞黏附、細胞因子改變等相互交織,相互影響,相互作用[14]。外周血單核細胞遷入動脈內皮下間隙,分化成巨噬細胞是動脈粥樣硬化的最早事件,這一事件的發生至少需要兩個條件,即單核細胞的活化和黏附分子的參與。整合素家族的CD1lb是黏附家族的重要成員之一,在白細胞黏附于血管內皮細胞中起突出作用。實驗證實,活化粒細胞和單核細胞的 CD1lb表達量顯著增加,CDllb在白細胞表面的表達已成為白細胞活化的標志[15]。ICAM-l為CD11b的配體,ICAM-1基因啟動子上有1個基本的NF-κB位點,VCAM-1基因有2個NF-κB位點。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能與白細胞表面的配體相應地結合,介導白細胞的貼壁黏附,致白細胞聚集、浸潤,從而導致局部炎癥的發生[16]。黏附分子CD11b與ICAM-1的表達影響著中性粒細胞的跨內皮移行作用,且這兩種分子有協同作用。兩者同樣在白細胞的黏附及遷移中扮演著重要的角色。NF-κB活化后能調控一系列基因的表達,如黏附分子家族的細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等,研究表明[17],ADP激活的血小板能誘導內皮細胞分泌MCP-1,促進其表面表達 ICAM-1,NF-κB的激活是動脈粥樣硬化的始動機制。

實驗結果顯示,高脂飼料組大鼠巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達率較正常對照組明顯上升,表明高脂血癥大鼠模型成功,大鼠處于炎癥狀態。高脂＋普通飼料組大鼠巨噬細胞CD11b、ICAM-1表達率較高脂飼料組明顯下降,較正常組仍明顯上升,說明合理的飲食對控制高脂血癥有一定療效,但療效有限[18],仍需結合針灸進行治療。高脂＋普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較,CD11b、ICAM-1表達率明顯降低;直線相關分析結果顯示,CD11b與 ICAM-1水平呈顯著正相關,表明CD11b與ICAM-1在抑制炎癥反應方面有一定的協同作用,這與Zhang等[19]研究是相符的。此外,電針豐隆穴能夠改善高脂血癥引起的炎癥反應,其機制可能由于電針豐隆穴下調CD11b及黏附分子ICAM-1高表達,抑制NF-κB的激活,從而阻斷NF-κB調控的炎癥反應,改善其介導的微循環障礙,減輕機體組織的損傷。然而,這一過程涉及到的機制是十分復雜的,未來對此還需要更深一步的研究探索。

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