穴位埋線對慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質細胞的影響

尹平,徐世芬,高寧陽,吳君怡,朱博暢

(1.上海中醫藥大學附屬上海市中醫醫院,上海 200071;2.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所,上海 201203)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是一類以結腸傳輸減慢為特點的頑固性便秘,約占功能性便秘的45.5%,臨床上最為常見[1]。STC病程較長,內科各種保守治療措施效果有限,大多數患者需要長期依賴各種刺激性瀉劑排便,部分患者最終需手術切除傳輸遲緩的結腸方能解除癥狀[2]。所以,探尋其有效的治療方法是我們醫學領域的研究方向。近年來,較為統一的研究觀點認為Cajal間質細胞在結腸中的分布和功能異常可能是STC結腸慢波頻率減慢的直接或間接原因。而穴位埋線作為目前臨床治療STC的有效方法之一,兼具操作簡便、經濟省時、易于患者接受的特點。故本研究擬通過觀察穴位埋線對STC模型大鼠腸道傳輸功能及其結腸組織 Cajal間質細胞的影響,探討穴位埋線治療STC的可能作用機制及不同穴位調節STC的穴位特異性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠34只,體質量(180±10)g,雌雄各半,由上海中醫藥大學動物實驗中心提供,動物合格證號為SCXK(滬)2008-0016。實驗動物飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心,給予標準光照周期(14 h光照、10 h黑夜),室內溫度(20±2)℃,濕度(50±10)%,標準飼料,高壓滅菌墊料和飲水。實驗動物中心許可證號為SYXK(滬)2004-0005。

1.2 主要試劑及器材

冰凍包埋切片機(CM3050S,德國 Leica),倒置顯微鏡(1X71,日本 Olympus),電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型,上海精宏實驗設備有限公司),電子天平(JA10002,上海精天電子儀器有限公司),兔多抗 c-kit抗體(一抗)(美國abcam公司),SABC(兔IgG)-POD kit試劑盒(免疫組化試劑盒)(北京索萊寶科技有限公司),大黃顆粒劑(產品批號為 1106202,江陰天江藥業有限公司),無菌注射針(規格 ?0.7×32 TWLE,上海米沙瓦醫科工業有限公司),醫用羊腸線(規格為 3～0,B30,鉻制,上海浦東金環醫療用品有限公司),平頭毫針(規格0.30 mm×50 mm,無錫佳健醫療器械有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將34只SD大鼠隨機分為5組,即正常組(6只)、模型組(7只)、天樞組(7只)、上巨虛組(7只)及大腸俞組(7只)。

1.3.2 模型制備

參照文獻[3]方法,模型組、天樞組、上巨虛組及大腸俞組每只大鼠給予每日灌服大黃粉懸液,首次大黃用量為200 mg/(kg·d),以此遞增直至出現半數大鼠糞便變稀,然后保持此劑量至80%的稀便消失,然后再在此基礎上按200 mg/(kg·d)遞增給藥,直到又有近半數大鼠出現腹瀉,如此循環3次,待最后1次80%稀便消失,然后停止給藥1星期,從而誘導實驗性STC大鼠模型。采用首粒黑便排出時間判定模型成功建立與否。

1.3.3 穴位選擇及處理方法

天樞、上巨虛、大腸俞穴位定位參照林文注主編《實驗針灸學》[4]。

天樞組、上巨虛組及大腸俞組每只大鼠,在造模成功的基礎上,分別給予天樞、上巨虛及大腸俞穴位埋線處理,每7 d治療1次,4次為1個療程,共計28 d。

穴位埋線操作方法,先將“3～0”醫用羊腸線剪成長度約為0.5 cm的線段若干,置于消毒彎盤中,然后將羊腸線從注射針的針尖處穿入(此時線頭與針尖內緣齊平)。消毒穴位區相應皮膚,然后將無菌注射針刺入相應穴位到達預定深度,先稍稍后退針,隨后用手指抵住毫針針尾做注射狀,緩慢將羊腸線推入穴位內,當注射針內有空虛感時,方可出針,并確認羊腸線已埋入大鼠肌內,埋線完畢,大鼠穴位處無需特殊處理。

1.3.4 組織取材

治療結束后,各組大鼠均禁食、不禁水24 h。采用100 g/L活性碳懸液2 mL灌胃30 min后,頸椎脫臼法處死。剖腹立即取距盲腸端2 cm處結腸組織約1 cm,用預冷生理鹽水沖洗腸內容物,裝入預先標記分組的凍存管后迅速投入液氮,于﹣70℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.5 觀察指標及測試方法

1.3.5.1 大鼠6 h內首粒黑便排出時間、大便重量及碳推進百分率(%)

采用活性碳灌胃法測定,經口灌入100 g/L的活性碳懸液2 mL,并將大鼠分別予代謝籠里觀察,從活性碳灌胃完畢開始計時,記錄從灌胃到大鼠首粒黑便排出時間,6 h內大便重量。

采用活性碳推進試驗檢測腸道傳輸功能,碳推進百分率(%)=(碳末前端與幽門的距離/腸道全長)×100%。摘除從幽門到直腸末端的全部腸道,在松弛狀態下測量腸道的全長及活性碳懸液在腸道內推進的長度,并計算活性碳懸液推進長度與腸道全長的百分比。

1.3.5.2 Cajal間質細胞的免疫組化染色

結腸組織用OCT包埋后放于冰凍切片機中,每個標本連續切片3張,片厚5 μm,按照SABC(兔IgG)-POD kit試劑盒說明書操作。切片于PBS緩沖液浸泡5 min,枸櫞酸鈉熱修復抗原,自然冷卻3～5 min后,PBS緩沖液浸泡5 min。置3%雙氧水中孵育10 min,用PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加適當稀釋的兔抗鼠多克隆c-kit抗體(按1:200稀釋),濕盒內﹣4℃孵育過夜,PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加二抗,室溫孵育30 min,PBS緩沖液沖洗2 min×3次。DAB顯色10 min,蒸餾水沖洗,蘇木素復染5 min,常規脫水,封片。在Olympus(1X71)型熒光倒置相差顯微鏡下,每張切片隨機選3個高倍鏡視野(10×40)觀察,應用Image-Pro Plus 5.0圖形分析系統拍照并計算Cajal間質細胞免疫染色陽性細胞個數。

1.4 統計學方法

所得數據均以均數±標準差表示。采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析。采用One-way-ANOVA單因素方差分析進行統計,P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠6 h內首粒黑便排出時間、大便重量及碳推進百分率的比較

由表1可見,大鼠6 h內首粒黑便排出時間,模型組、大腸俞組(P＜0.01)及上巨虛組(P＜0.05)均高于正常組;天樞組與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05);天樞組、上巨虛組、大腸俞組均低于模型組(P＜0.01);上巨虛組、大腸俞組均高于天樞組(P＜0.01)。6 h內大便重量,模型組低于正常組(P＜0.01);天樞組、上巨虛組、大腸俞組均高于模型組(P＜0.01);上巨虛組、大腸俞組與天樞組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。碳推進百分率(%),模型組、大腸俞組(P＜0.01)及上巨虛組(P＜0.05)皆低于正常組;天樞組、上巨虛組、大腸俞組均高于模型組(P＜0.01);大腸俞組碳推進百分率(%)低于天樞組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠6 h內首粒黑便排出時間、大便重量及碳推進百分率的比較 (±s)

表1 各組大鼠6 h內首粒黑便排出時間、大便重量及碳推進百分率的比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01;與天樞組比較4)P＜0.05,5)P＜0.01

組別 n 首便時間(min)6 h大便重量(g)百分率(%)正常組 6 195.17±22.36 6.83±1.24 67.94±2.26模型組 7 308.00±28.132) 4.30±0.452) 50.89±6.252)天樞組 7 194.14±14.113) 7.04±0.903) 65.52±5.163)上巨虛組 7 227.14±15.431)3)5) 7.01±0.863) 61.55±3.551)3)大腸俞組 7 233.14±20.602)3)5) 6.83±0.763) 59.94±6.442)3)4)

2.2 穴位埋線對大鼠結腸Cajal間質細胞的影響

正常組相鄰Cajal間質細胞呈帶狀或網絡狀結構,胞體呈紡錘形或梭形;模型組Cajal間質細胞網絡結構被破壞,分布不連續,形態也多異常;經4次穴位埋線治療后,天樞組、上巨虛組、大腸俞組大鼠結腸Cajal間質細胞的形態分布及網絡結構多與正常組接近。模型組與正常組相比,大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達數量明顯減少(P＜0.01)。天樞組、大腸俞組(P＜0.01)和上巨虛組(P＜0.05)與模型組相比,大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達數量均明顯增加。天樞組與上巨虛組、大腸俞組相比,大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達數量增加較明顯(P＜0.01)。大腸俞組與上巨虛組相比,大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達數量增加較明顯(P＜0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞的變化(免疫組化,×400)

表2 各組大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達的比較(±s)

表2 各組大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達的比較(±s)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01;與天樞組比較4)P＜0.01;與上巨虛組比較5)P＜0.05

組別 n 陽性細胞數(個)正常組 6 67.17±4.96模型組 7 38.86±3.291)天樞組 7 53.86±3.291)3)上巨虛組 7 43.57±2.441)2)4)大腸俞組 7 47.43±2.941)3)4)5)

3 討論

目前,有關STC的發生機理尚不十分明確,對其發病機制的研究主要集中在腸道形態學的改變和胃腸神經肽的改變方面。近年來,較為統一的研究觀點認為Cajal間質細胞在結腸中的分布和功能異常可能是STC結腸慢波頻率減慢的直接或間接原因。結腸組織中的Cajal間質細胞的數量、體積和超微結構的改變,引起異常的不規則慢波,由此誘發的動作電位使平滑肌產生不規則的或無效的收縮,使結腸功能紊亂,運轉緩慢,糞便通過時間延長,導致慢傳輸型便秘的發生。研究發現[5],STC患者結腸平滑肌內有大量包涵體形成,而它的出現會導致平滑肌收縮性下降,進而減慢胃腸傳輸速度。Lee JI等[6]對STC患者乙狀結腸標本研究發現,各層組織中ICC數量均減少。林琳等[7]對嗎啡誘導的結腸慢傳輸型小鼠結腸Cajal間質細胞的表達進行觀察,發現45 d后實驗組小鼠近端結腸組織陽性細胞較對照組顯著減少,60 d后嗎啡組的陽性細胞較納洛酮阻斷組和對照組顯著減少,提示近端結腸Cajal間質細胞的減少可能是結腸慢傳輸運動的原因之一。

穴位埋線作為目前臨床治療STC的有效方法之一。現代研究表明穴位埋線能改善大腸運動狀態,加速對糞便的推進,此作用通過興奮副交感神經,同時抑制交感神經,增加大腸液分泌,以利于潤滑作用;同時還能糾正胃腸道肌電的紊亂狀況[8],從而調節胃腸蠕動。穴位作用的特異性是臨床配穴及取得療效的關鍵,也是針灸研究的熱點問題。在臨床治療STC中,我們經常用到的穴位有天樞、大腸俞、上巨虛,而它們對大腸功能有著各自的特異性效應。天樞乃足陽明胃經的腹部要穴及大腸經氣所聚集之處,為治療便秘的重要穴位[9]。天樞為大腸之募穴,腑氣之所通。天樞又緊鄰脾胃,為氣機運行之樞機。大腸俞可補大腸津液而潤腸通便,常與天樞俞募相配,相得益彰。上巨虛為大腸經下合穴,根據《靈樞·邪氣臟腑病形》“合治內府”理論,故上巨虛穴能治療大腸疾病,疏導腸腑而治療便秘,同時它又位于足陽明胃經上,可使胃與大腸共調,增強腸蠕動,使腑氣下行,推動腸道內糞便下排。因此,本次研究通過觀察穴位埋線對STC模型大鼠腸道傳輸功能及其結腸組織Cajal間質細胞的影響,來試圖探討穴位埋線治療STC的可能作用機制及不同穴位調節STC的穴位特異性。在研究中我們發現,天樞、上巨虛、大腸俞對大鼠6 h內首粒黑便排出時間均有改善作用,能顯著縮短排便時間,且天樞的作用效果更優于上巨虛和大腸俞(P＜0.01);天樞、上巨虛、大腸俞對大鼠6 h內大便重量有改善作用,能增加大鼠排便重量。天樞組、上巨虛組及大腸俞組對碳推進百分率均有顯著改善作用,均能使其得到明顯提高(P＜0.01)。但天樞組較大腸俞組在改善程度方面更為明顯。模型組Cajal間質細胞網絡結構被破壞,分布不連續,形態也多異常,提示Cajal間質細胞的病理改變可能是STC的發病機制之一。經穴位埋線治療后,天樞組、上巨虛組、大腸俞組大鼠結腸Cajal間質細胞的形態分布及網絡結構多與正常組接近,且天樞組與上巨虛組、大腸俞組相比,大鼠結腸Cajal間質細胞陽性細胞表達數量增加較明顯(P＜0.01),提示穴位埋線能改善結腸組織中Cajal間質細胞的表達,以達到治療目的,且不同穴位調節STC存在穴位特異性,特別是天樞更具有明確治療STC的臨床選取應用意義。但穴位埋線是通過何種途徑改善STC結腸平滑肌結構及Cajal間質細胞的病理改變,還有待我們進一步的深入研究。

[1]李乾元,楊關根.慢傳輸便秘發病機理的研究[J].光明中醫,2009,24(12):2394-2395.

[2]Liu LW, Thuneberg L, Huizinga JD. Seletive lesioning of interstitial cells of Cajal by methylene blue and light leads to loss of slow waves[J]. Am J Physiol, 1994,266(3Pt 1):G485-496.

[3]張連陽,高峰,童衛東,等.大鼠瀉劑結腸模型的建立[J].華人消化雜志,1998,6(10):864-866.

[4]林文注,王佩.實驗針灸學[M].上海:上海科學技術出版社,1999:270.

[5]Ding JH, Fu CG, Zhao RH, et al. Serotonin transporter gene polymerphism in slow transit constipation[J]. Chin J Gastrointest Surg, 2006,9(4):328-330.

[6]Lee JI, Park H, Kamm MA, et al. Decreased density of inters- titial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slow-transit constipation and acquired megacolon[J]. J Gastroenterol Hepatol,2005,20(8):1292-1298.

[7]林琳,姜柳琴,張紅杰,等.慢傳輸運動小鼠結腸組織中Cajal間質細胞的改變[J].胃腸病學,2006,11(8):462-467.

[8]趙亞偉,葛兆希.穴位埋線配合中頻電療治療慢傳輸型便秘的臨床研究[J].臨床醫學工程,2009,16(8):98-99.

[9]Duan JX, Peng WN, Liu ZS, et al. Clinical study on deep insertion at Tianshu (ST 25)for colonic slow transit constipation[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2011,9(1):46-50.