響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取苦瓜多糖工藝的研究

陳洋洋，李盈蕾，周燕紅*

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100;2.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院)

目前的研究報(bào)道，已經(jīng)從苦瓜中分離出的化學(xué)成分有糖類、皂苷類、生物堿類、蛋白質(zhì)類、脂類、甾類、萜類、微量元素等多種成分［1］。苦瓜多糖是苦瓜中含量較高的天然生物活性物質(zhì)之一，幾乎無毒副作用，在治療腫瘤、抗衰老、病毒性疾病等方面療效獨(dú)特［2］。因此，探索苦瓜多糖最佳提取條件在化工、醫(yī)療方面意義重大。

微波輔助萃取技術(shù)是一種新型的萃取技術(shù)，是利用一種波長極短、頻率很高的輻射能來加熱物料達(dá)到萃取目的的方法，已經(jīng)用于多項(xiàng)中草藥的浸提生產(chǎn)線之中。為優(yōu)化苦瓜多糖的微波輔助提取工藝，利用SAS軟件和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，研究各自變量及其交互作用對多糖提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 材料:苦瓜(市購)、濃硫酸(95.5%)、分析純葡萄糖、苯酚(80%)、乙醇(85%)等均為國產(chǎn)分析純。儀器:超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)、紫外-可見分光光度儀、循環(huán)水真空泵、電熱恒溫水浴鍋、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟 ①苦瓜多糖的提取、分離工藝:鮮苦瓜→去籽→切片→干燥→粉碎→水浸提→過濾→澄清液→濃縮液→醇沉→洗滌→干燥→苦瓜粗多糖。②苦瓜多糖的定量測定方法:苦瓜多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法。但苦瓜多糖是一種由半乳糖、甘露糖等組成的雜多糖，且多糖中各種單糖的組成與品種也有關(guān)系，所以單純用葡糖糖作標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算苦瓜多糖的含量必然會存在一定的偏差。參考董群等［3］的研究成果，確定苦瓜多糖對葡萄糖的校正系數(shù)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.2 苦瓜多糖提取率的計(jì)算方法 苦瓜多糖提取液與苯酚-硫酸反應(yīng)后，用紫外可見分光光度計(jì)測定提取液的吸光度，再由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合校正系數(shù)，計(jì)算多糖的含量，并計(jì)算提取率。提取率:式中 n-稀釋倍數(shù)c-多糖濃度，mg/ml;v-提取液體積 ml;M-苦瓜干重 g。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.1 葡萄糖最大吸收波長的選擇 準(zhǔn)確配制并稱量50 mg/L的葡萄糖溶液，用苯酚-硫酸顯色，以蒸餾水為參比，在400～650 nm之間每隔10 nm測一次吸光度，在最大吸收波長附近，每隔5 nm測定一次吸光度。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選葡萄糖最大吸收波長為490 nm。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2003g(提前105℃干燥箱至恒重)，置于容量瓶中(200 ml)，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，配成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別移取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于 100 ml容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，配成系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取0.33g苯酚，加入100 ml濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻后置于冰箱中。再分別準(zhǔn)確移取1 ml系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液至具塞試管中，以1 ml蒸餾水作空白，每試管再加入4 ml苯酚-硫酸試液，立即搖勻，置于冰水浴中，然后一起置于沸水浴中加熱7min，之后用流動自來水迅速冷至室溫，放置10min后，于490 nm處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。葡萄糖濃度在0～20 mg/L之間時(shí)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2在0.998以上。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對提取率的影響 取4份10 g樣品，分別加入 100 ml、150 ml、200 ml、250 ml的蒸餾水，在500W功率下分別提取20min，過濾、濃縮至30 ml，加入2倍體積(60 ml的95%的乙醇)醇沉24 h。離心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取0.5 ml加入1 ml苯酚(5%)和4 ml濃硫酸在60℃水浴條件下加熱30 min，測吸光度A值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算提取率。

由圖1可知，料液比從1∶15提高到1∶20時(shí)，苦瓜多糖含量急劇上升，但隨著料液比的繼續(xù)提高，苦瓜多糖含量則出現(xiàn)下降的趨勢。綜合考慮溶液的效價(jià)比和成本工業(yè)浸提，宜選用1∶15～1∶20之間的浸提液。

圖1 料液比對提取率的影響

2.1.2 微波萃取功率對提取率的影響 在4份10 g樣品中，加入200 ml蒸餾水，微波萃取功率分別為 300、400、500、600 W，抽濾，濃縮、醇沉、離心、溶解、定容，吸取0.2 ml加入苯酚和硫酸測吸光度A值，得提取率。

圖2 微波萃取功率對提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)微波輔助萃取的功率從300W提高到400W時(shí)，苦瓜多糖含量急劇上升，隨著微波功率的繼續(xù)提高，開始大幅下降。因此，微波輔助的功率選擇為400～500W之間。

2.1.3 提取時(shí)間對提取率的影響 在4份10 g樣品中，按1∶20加入200 ml蒸餾水，溫度設(shè)定為50℃，在400W功率條件下分別提取10、15、20、30min。過濾、濃縮至30 ml，加入2倍體積(即60 ml的 95%的乙醇)醇沉 24 h。離心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取 0.5 ml加入 1 ml苯酚(5%)和 4 ml濃硫酸在60℃水浴條件下加熱30 min，測吸光度A值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算提取率，見圖3。

圖3 提取時(shí)間對提取率的影響

從圖3可以看出，提取率隨著提取時(shí)間先升高然后下降。在15 min以內(nèi)，苦瓜多糖的提取率穩(wěn)步上升，隨后上升比較緩慢，到20min時(shí)，基本達(dá)到飽和狀態(tài)，進(jìn)一步延長浸提時(shí)間，提取率略有下降，可能是由于長時(shí)間高溫提取，導(dǎo)致部分多糖分解所致，故提取時(shí)間選擇在10～20 min為宜。

本科教育質(zhì)量是高校辦學(xué)的生命線，只有不斷地深化改革課程內(nèi)容，結(jié)合學(xué)校的實(shí)際情況，積極探索與開發(fā)新型體育課程，才能更好地維系這條生命線。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，西方文化的滲透，體育項(xiàng)目對現(xiàn)代年輕人的影響也越來越深。民間體育經(jīng)過收集、整理、研究、改編之后，完全可以成為一門具有中國特色的課程，成為休閑體育專業(yè)中一門重要的課程。

2.1.4 不同溫度對苦瓜多糖提取的影響 取5份10 g樣品，加入200 ml蒸餾水，用微波輔助萃取法萃取，功率為400 W，分別于反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中提取時(shí)間為 20 min。抽濾，濃縮、醇沉、離心、溶解、定容，分別提取0.2 ml測吸光度A值，分別計(jì)算提取率。見圖4。

圖4 溫度對提取率的影響

圖4顯示出:50℃時(shí)是提取的最佳溫度，50℃提取的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在30℃的提取量，但隨著溫度的繼續(xù)增高，多糖的量出現(xiàn)緩慢減少的趨勢，而且溫度越高對苦瓜多糖的生物活性也有不利的影響。這一結(jié)果與吳笳笛［4］的研究結(jié)果也基本一致。選擇在50℃的水溫來提取苦瓜多糖是比較適當(dāng)。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中的設(shè)計(jì)模型，以微波功率、提取時(shí)間、料液比為自變量，根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平，見表1。自變量的編碼值1、0、-1分別代表高、中、低水平，提取率為響應(yīng)值，用Y表示。響應(yīng)面分析試驗(yàn)(見表2)。以1～12為析因試驗(yàn)，13～17為中心點(diǎn)試驗(yàn)。

17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算試驗(yàn)誤差。采用SAS的RSREG程序進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從圖上可以形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。模型中如果只有一個(gè)因素(或自變量)，響應(yīng)面是二維空間中的一條曲線;當(dāng)有二個(gè)因素時(shí)，響應(yīng)面是三維空間中的曲面。當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘曲面，有極大值存在;當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無極值存在［5］，見圖5。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

圖5 微波功率與提取時(shí)間對苦瓜多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線

在料液比為1∶20時(shí)，二者對苦瓜多糖提取率的交互影響效應(yīng)顯著。微波功率升高有助于苦瓜多糖的提取，表現(xiàn)為曲線較陡，當(dāng)功率達(dá)到一定大小時(shí)，多糖提取率反而下降，說明過高過低的功率均不利于提取。提取時(shí)間對苦瓜多糖提取率的影響在圖中也表現(xiàn)為曲線較為陡峭，時(shí)間過長或過短對多糖的提取造成一定的影響。

圖6 微波功率與料液比對苦瓜多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線

圖6顯示在提取時(shí)間水平為0，即15min時(shí)，微波功率與料液比的交互影響效應(yīng)不是太顯著，多糖提取率的響應(yīng)值變化較小。

圖7 提取時(shí)間與料液比對苦瓜多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線

各因素經(jīng)回歸擬合后，得:

圖5～7反映了各因素對響應(yīng)值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。比較三組圖可知:微波功率(X1)和提取時(shí)間(X2)對苦瓜多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;而料液比(X3)次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

用回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和全體自變量之間線性關(guān)系是顯著的。從回歸方程各項(xiàng)方差的檢驗(yàn)可知，方程的失擬項(xiàng)很小，表明該方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的，因此各具體實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，這與單因素試驗(yàn)的結(jié)論也吻合。

為確證最佳點(diǎn)的值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零并整理，得:

得:X1=-0.74，X2=-0.13，X3=-0.16。

可得提取最佳條件為:微波功率413.10W、提取時(shí)間14.35min、固液之比1∶19.22。苦瓜多糖提取率的理論值可達(dá)4.819%。為檢驗(yàn)SAS法的可靠性，在此最優(yōu)提取條件下，進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際測得的平均提取率為4.798%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差在0.4% 左右。故采用SAS法優(yōu)化得到的浸提條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 最佳工藝條件重復(fù)實(shí)驗(yàn) 取3份10g樣品，加入230ml蒸餾水，在最佳工藝條件下，即微波功率413.10W、料液比例1∶19.22的環(huán)境中提取14.35min。分別提取0.2ml測吸光度A值，分別計(jì)算提取率，為4.798%，4.789%，4.808%，平均值為4.798%。

3 結(jié)論

結(jié)果表明:微波輔助提取苦瓜多糖的最佳條件為:微波功率413.10W，提取時(shí)間14.35min，料液比為1∶19.22(W∶V)。此條件下，平均提取率達(dá)到4.798%，與預(yù)測的理論值4.819% 相差甚少，說明采用該法所得到的提取條件參數(shù)可靠，3次可重復(fù)性良好。

［1］潘國慶.苦瓜的化學(xué)成分及藥理作用［J］.青海科技，2004，11(6):30

［2］董加寶，李芳.苦瓜多糖的制備及其抗氧化性質(zhì)研究［J］.湖南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(8):51

［3］董群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，1996，9(31):550

［4］吳笳笛.雙酶水解法提取水溶性苦瓜多糖的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，3(1):73

［5］毛婷，董靜，龔麗，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助萃取橙皮精油的工藝研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(1):84