超分辨率熒光顯微技術

葛春洋+馬宏佳

摘要：介紹了2014年諾貝爾化學獎獲獎成果超分辨率熒光顯微技術的原理和發現過程、獲獎者簡況以及超分辨率熒光顯微技術的應用前景。

關鍵詞：諾貝爾化學獎；超分辨率熒光顯微鏡；受激發射損耗顯微鏡；光激活定位顯微鏡

文章編號：1008-0546（2014）11-0002-03 中圖分類號：G633.8 文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2014.11.001

北京時間2014年10月8日，瑞典皇家科學院宣布，將2014年諾貝爾化學獎授予美國科學家埃里克·貝齊格（Eric Betzig）、威廉姆·莫納（William Esco Moerner）和德國科學家斯特凡·赫爾（Stefan W. Hell），以表彰他們為發展超分辨率熒光顯微鏡所做的貢獻。

一、光學顯微鏡分辨率極限的存在

長期以來，光學顯微鏡的分辨率被認為不會超過光波波長的一半，這被稱為“阿貝衍射極限”。1873年，德國科學家阿貝（E.Abbe）揭示了遠場光學顯微鏡分辨率由于光的衍射效應和有限孔徑分辨率極限而存在極限。這是由于可見光具有波動性，其可以發生衍射，因此光束不能無限聚焦。他的結論源于光學顯微鏡的分辨率的計算公式：

其中λ為光波波長，α為鏡口角的一半，n為傳播介質的折射系數。空氣中n為1，α最大可為70度，此時，sinα約為0.94，根據波長最短的藍光計算，λ≈450nm，則分辨率最小約為200nm。即阿貝分辨率極限的數值約為200nm。

1896年，英國物理學家瑞利（Rayleigh）提出，在成像光學系統中，分辨率是衡量分開相鄰兩個物點的像的能力。由于衍射，系統所成的像不再是理想的幾何點像，而是一定大小的光斑（愛里斑），當兩個物點過于靠近，其像斑重疊在一起，就可能分辨不出是兩個物點的像，即光學系統中存在著一個分辨極限，這個分辨極限通常采用瑞利提出的判據：當一個愛里斑的中心與另一個愛里斑的第一級暗環重合時，剛好能分辨出是兩個像，他歸納出一個常用分辨率公式：

Δmin=（λ為光波波長，α為鏡口角的一半，n為傳播介質的折射系數。）

這從另一個角度印證了“阿貝衍射極限”理論。因此，人們認為光學顯微鏡的成像效果受到光的波長限制，最大分辨率為光波的1/2。

二、光學顯微鏡分辨率極限的突破

科學發展的進程激發人們對更小物質的研究渴望，因此科學家們一直致力于超分辨率顯微鏡的研究。2014年諾貝爾化學獎的三位得主以創新手段“繞過”（突破）了這一極限，使光學顯微鏡的分辨率從微米級提高到納米級，他們的發現使顯微鏡進入納米顯微鏡時代。

（1）斯特凡·赫爾的貢獻

2014年諾貝爾化學獎得獎的原理主要為兩項，其一為斯特凡·赫爾研發的受激發射損耗顯微技術（stimulated emission depletion，STED）。所謂的受激發射損耗（STED），指的是用一束激發光使熒光物質發光的同時，用另外的高能量脈沖激光器發射一束環型的波長較長的激光，將第一束光斑中大部分的熒光物質通過受激發射損耗過程淬滅至基態，并通過限制受激發射抑制的區域，獲得小于衍射極限的發光點，從而顯著地提高了顯微鏡的分辨率。2000年，赫爾使用STED顯微鏡首次得到了大腸桿菌的圖像。

（2）埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納的貢獻

第二項原理由埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納研究，即單分子顯微鏡的原理。該原理的核心為激活和淬滅單個熒光分子。他們通過每次分辨少數分散的分子，多次沉積這些圖像得到一個納米級的高密度的超級圖像。

在莫納之前，人們觀測熒光分子時都是同時觀測到幾百萬幾千萬個分子，得到的結果是其平均統計結果。而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，他于1989年觀測到單個熒光分子。能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要。雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2微米的光斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以更精確地被確定下來的。

1997年莫納發現變異的綠色熒光蛋白可以隨意打開和關閉，當他用波長488nm的光線去激發某種蛋白質時，它開始發出熒光，但一會熒光就消失了。此后不管他再使用任何光線去照射它，這個蛋白質都無法再發出熒光。但是，當他用波長為405nm的光線去照射它的時候，蛋白質又再次復活并發出熒光。莫納將這些可以被激發的蛋白質融入溶膠，使其均勻分布在其中，這使得單個分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限。由于這些分子被分散開來，一臺常規的光學顯微鏡便可以區分來自單個分子發出的熒光——它們就像是帶著開關的小燈泡。

貝齊格發明的光激活定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫納發現的光激活方法。貝齊格利用微量的405nm激光照射細胞表面，使得其中極小部分熒光分子發出熒光。然后用488nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子，確定這些分子的位置。再依次用405nm和488nm的激光照射，以激活另一小部分熒光分子。重復這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了比傳統光學顯微鏡至少高10倍以上分辨率的整個樣品的圖像。

值得一提的是，華裔科學家莊小威與貝齊格的工作在物理原理上完全一樣。莊小威課題組獨立發明的STORM技術使用激光“點亮”或“熄滅”細胞中的熒光，然后拍照。每次只“點亮”或“熄滅”細胞中一個位置。像逐行掃描一樣，一點點記錄細胞的圖像，最后通過多幅圖像疊合，得到完整、高分辨率圖像。莊小威發表的論文顯示，分辨率可以達到20納米。兩者的細微不同之處在于激發熒光材料的使用上，貝齊格用的是光敏蛋白，而莊小威用的是熒光染料。莊小威的相關論文于2006年8月9日發表在《自然·方法》期刊，而貝齊格的論文于次日（8月10日）發表在《科學》期刊，不過貝齊格的論文投出時間為2006年3月，比莊小威要早4個月。但貝齊格早在1995年就發表了理論設計論文。諾貝爾獎授予者解釋說這是莊小威憾失諾貝爾獎的原因。但她在超分辨率顯微鏡領域做出的貢獻仍不可否認。

三、獲獎成果應用前景

科學家們的成果將顯微技術帶入“納米”領域，讓人類能夠“實時”觀察活細胞內的分子運動規律，為疾病研究和藥物研發帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學家們在分子水平上對活體細胞進行研究，如觀察活細胞內生物大分子、細胞器微小結構以及細胞功能如何在分子水平表達及編碼，對于理解生命過程和疾病發生機理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發作時，科學家們可以跟蹤與之有關的蛋白質的變化；受精卵分裂并發育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質的變化。正如諾貝爾化學獎評審委員會所說，三位科學家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質結構小得無法研究。”

四、獲獎者簡介

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學家，馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長。1990年獲得海德堡大學物理學博士學位。1997年，在馬克斯·普朗克學會在哥廷根的生物物理化學研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學顯微技術部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓。化學家，單分子光譜和熒光光譜領域的著名專家。畢業于圣路易斯華盛頓大學。1982年，獲得康奈爾大學物理學博士學位。1998年至今，在斯坦福大學擔任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經科學家、發明家、應用物理學家。霍華德·休斯醫學研究所的研究帶頭人。他畢業于加州理工學院的物理學系，1988年獲得美國康奈爾大學博士學位。后在貝爾實驗室工作。

參考文獻

[1] M？覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[2] M？覽ns Ehrenberg，Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[3] 毛崢樂，王琛，程亞等. 超分辨遠場生物熒光成像——突破光學衍射極限[J]. 中國激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 呂志堅，陸敬澤，吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術的原理和近期進展[J]. 生物化學與生物物理進展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 楊鵬，艾華. 受激發射損耗顯微術及擴展技術[J]. 激光與光電子學進展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

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三、獲獎成果應用前景

科學家們的成果將顯微技術帶入“納米”領域，讓人類能夠“實時”觀察活細胞內的分子運動規律，為疾病研究和藥物研發帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學家們在分子水平上對活體細胞進行研究，如觀察活細胞內生物大分子、細胞器微小結構以及細胞功能如何在分子水平表達及編碼，對于理解生命過程和疾病發生機理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發作時，科學家們可以跟蹤與之有關的蛋白質的變化；受精卵分裂并發育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質的變化。正如諾貝爾化學獎評審委員會所說，三位科學家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質結構小得無法研究。”

四、獲獎者簡介

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學家，馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長。1990年獲得海德堡大學物理學博士學位。1997年，在馬克斯·普朗克學會在哥廷根的生物物理化學研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學顯微技術部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓。化學家，單分子光譜和熒光光譜領域的著名專家。畢業于圣路易斯華盛頓大學。1982年，獲得康奈爾大學物理學博士學位。1998年至今，在斯坦福大學擔任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經科學家、發明家、應用物理學家。霍華德·休斯醫學研究所的研究帶頭人。他畢業于加州理工學院的物理學系，1988年獲得美國康奈爾大學博士學位。后在貝爾實驗室工作。

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三、獲獎成果應用前景

科學家們的成果將顯微技術帶入“納米”領域，讓人類能夠“實時”觀察活細胞內的分子運動規律，為疾病研究和藥物研發帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學家們在分子水平上對活體細胞進行研究，如觀察活細胞內生物大分子、細胞器微小結構以及細胞功能如何在分子水平表達及編碼，對于理解生命過程和疾病發生機理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發作時，科學家們可以跟蹤與之有關的蛋白質的變化；受精卵分裂并發育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質的變化。正如諾貝爾化學獎評審委員會所說，三位科學家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質結構小得無法研究。”

四、獲獎者簡介

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學家，馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長。1990年獲得海德堡大學物理學博士學位。1997年，在馬克斯·普朗克學會在哥廷根的生物物理化學研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學顯微技術部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓。化學家，單分子光譜和熒光光譜領域的著名專家。畢業于圣路易斯華盛頓大學。1982年，獲得康奈爾大學物理學博士學位。1998年至今，在斯坦福大學擔任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經科學家、發明家、應用物理學家。霍華德·休斯醫學研究所的研究帶頭人。他畢業于加州理工學院的物理學系，1988年獲得美國康奈爾大學博士學位。后在貝爾實驗室工作。

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[4] 呂志堅，陸敬澤，吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術的原理和近期進展[J]. 生物化學與生物物理進展，2009，36（12）：1626-1634

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[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

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