毛細管電泳在β地中海貧血中的應用研究

游雪云，劉艷秋，吳敏

(1、江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西 南昌330006；2、臨川區第一人民醫院檢驗科，江西 臨川344100)

據世界衛生組織1995年統計，世界人口的1.6%是β地貧基因攜帶者,中國是世界高發區之一，β地中海貧血 (β-thalassemia,以下簡稱β地貧)，是由于β珠蛋白基因突變或缺失導致β珠蛋白鏈合成受抑而引起的遺傳性溶血性貧血。我國人口基數大，殘疾兒發生率高，β0純合子或雙重雜合子為致死性異常，β0雜合β+是癥狀嚴重的存活型地貧，雖大部分能適應基本社會生活，但由于長期慢性溶血性貧血，導致患者肝脾腫大，生活質量極差。目前對本病缺乏有效的治療方法，篩查是預防重癥地貧兒出生的最好途徑，而毛細管電泳能夠定量檢測HbA、HbF、HbA2含量，可以有效地篩查出高危夫婦[1]；同時毛細管電泳具有快速、方便、所需樣本量少等優點。

毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)又叫高效毛細管電泳，是80年代初發展起來的一種新型分離分析技術，它是電泳與層析相結合的一種分離方法。為了解全自動毛細管電泳系統在β地貧篩查中的臨床應用價值，本研究對986例標本分別采用毛細管電泳和瓊脂糖凝膠電泳 (agarose gel electrophoresis，AGE)進行檢測，并與基因診斷結果進行比較，分析兩種方法的靈敏度和特異度，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2010年10月至2013年9月來我院進行產檢、婚檢或體檢的人群，年齡20至40歲之間，大致可分為4類：①血常規檢查發現MCV或MCH減少；②紅細胞脆性篩查<60%；③家庭中有地中海貧血攜帶者；④夫婦中有一方為地貧攜帶者而另一方主動要求篩查的，以上人群共計986例。分別進行毛細管血紅蛋白電泳和瓊脂糖凝膠血紅蛋白電泳檢測，并采用分子生物學技術進行地貧基因檢測。

1.2 儀器與試劑 毛細管電泳采用法國Sebia公司生產的Minicap全自動毛細管電泳儀及其配套血紅蛋白電泳試劑盒、質控品(SEBIA，PN 4778)。瓊脂糖電泳采用法國Sebia公司生產的Hydrasys Lc電泳儀，及配套的EPSON系統掃描儀。地貧基因診斷試劑盒由深圳益生堂生物企業有限公司生產提供。血常規測定用日本光電6318K全自動血細胞分析儀。

1.3 方法 986例血標本分別進行毛細管區帶電泳及瓊脂糖血紅蛋白電泳檢測。(1)全自動血細胞分析儀平行分析平均紅細胞體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度 (MCH)、血紅蛋白 (Hb)、細胞分布寬度(RDW)。(2)毛細管電泳檢測：將抗凝血標本離心沉淀，棄除上層血漿，把裝有血細胞的試管按順序放在儀器配套的轉盤上(位置1～26)，在轉盤的第27管位置加入裝有溶血劑的試管，約3h后全部檢測程序完畢，查看結果。(3)瓊脂糖血紅蛋白電泳檢測：標本進行洗滌、溶血制作溶血液；點樣；選擇相應程序進行電泳;30min儀器自動完成電泳、烘干等步驟；電泳完畢及時取出膠片，放入儀器染色單元，選擇相應程序，儀器自動進行沖洗、染色、脫色、烘干等步驟；染色結束，取出膠片，用配套的Hyrys系統掃描出結果。(4)17種β地貧基因 (41-42、71-72、IVS-II-654、 -28、17、B∑、31、43、 -32、27／28、-29、3O、14-15、CAP、Int、IVS-I-1、IVS-I-5)分析采用反向斑點雜交技術(RDB)進行分析檢測。

1.4 判斷標準[2,3]血紅蛋白電泳：正常成人HbA2為2.5%～3.5%，并且沒有出現異常血紅蛋白帶。如出現 HbA2≥3.5%和(或)出現 HbF＞2.0%，和(或)異常血紅蛋白則判為β地中海貧血表型陽性。

1.5 檢測評價指標 靈敏度(sensitivity，Se)=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度(specificity，Sp)=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%。

1.6 統計學分析 采用SPSS 11.5統計軟件包對數據資料進行分析，兩樣本比較用Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳和毛細管電泳分析檢測結果986例標本中瓊脂糖凝膠電泳檢出β地貧32例(含HbE 4例)，檢出率3.2%，其中2例同時合并HbF增高，檢出異常Hb8例。毛細管電泳系統共檢出β地中海貧血35例，檢出率3.5%，其中HbE增高6例，HbA2和HbF同時增高3例；檢出異常Hb9例。兩種電泳結果對照之后我們發現：瓊脂糖凝膠電泳檢出β地貧32例與毛細管電泳結果完全一致，但由于瓊脂糖凝膠電泳對HbE和HbA2區帶也不容易單獨區分，故漏檢了2例HbE，另外還漏檢了1例HbCS。將兩種血紅蛋白電泳結果通過列表分析確定以HbA2≥4.8%為篩查β地貧截斷值，而兩種血紅蛋白電泳對986例標本檢測的同時均采用PCR結合反向斑點雜交法RDB法[4]做進一步基因診斷；以此基因診斷結果為金標準 ，然后分別對兩種血紅蛋白電泳檢測β地貧表型陽性的靈敏度和特異度結果進行分析。結果表明毛細管電泳診斷β地貧靈敏度和特異度分別為82.3%和87.6%，瓊脂糖凝膠電泳診斷β地貧靈敏度和特異度分別為77.6%和81.7%，毛細管電泳檢測的靈敏度和特異度均高于瓊脂糖凝膠電泳。

2.2 兩種電泳檢測與基因檢測結果比較 986例標本中，毛細管電泳對35例β地貧檢出與基因檢測(PCR結合反向斑點雜交)結果吻合，而這35例β地貧標本通過瓊脂糖電泳有3例與基因檢測結果不吻合，其他標本兩種電泳結果均一致。但兩種電泳均無法發現β地貧中合并的α地貧，反向斑點雜交診斷為β地貧的35例攜帶者的基因型分別為：CDs41／42(-TCTT)／N 6 例，-28(A→G)／N 6 例，IVS-2—654(C-T)/N 9 例，CDl7(A→T)／N 5 例，CD43(G→T)／N 2 例，CDs71／72(+A)／N 1 例；診斷為HbE的6例攜帶者的基因型均為CD26(G→A)／N。兩種電泳檢測與基因診斷結果的符合率見表1。

表1 兩種電泳檢測后通過基因確診的β地貧符合率

3 討論

按照受累的氨基酸鏈來分類，地貧主要有α地貧(α鏈受累)和β地貧(β鏈受累)，全球每年約有超過26000例β地貧患者產生[5],在南方高發地區的人群基因攜帶率達3%～l0%[6]。β地貧可分為重型、中間型、輕型和靜止型基因攜帶者[7]，地貧在我國南方地區發病率很高，其中廣西、廣東、江西、四川發病率分別高達 14.95%、4.11%、2.60%、1.92%。而隨著流動人口的不斷增加及醫務人員對地貧的逐漸認識和重視及地貧的檢出率也逐年上升。國內外研究[8]結果表明，在地貧高發區，通過遺傳篩查、遺傳咨詢和產前診斷選擇性淘汰重癥地貧胎兒，是現實條件下控制重癥地貧胎兒出生的首要選擇。為了減少地中海貧血的發病率，江西省婦幼保健院于2010年開始把地中海貧血篩查作為一項常規檢測項目，對檢測為高風險的對象建議做進一步基因診斷，從而降低重癥患兒的出生率。

β地貧主要表現為HbA2、HbF增高或出現異常血紅蛋白，這些異常Hb分子量和所帶電荷不同于正常Hb，可利用電泳方法加以分離[9]。本文通過全自動毛細管電泳法檢出β地貧表型陽性35例，而瓊脂糖凝膠電泳法檢出32例，主要原因是全自動毛細管電泳法與瓊脂糖凝膠電泳法相比，在血紅蛋白區帶分辨上還具有以下優點：(1)HbE在瓊脂糖凝膠電泳中的表現為在HbA2前后出現淡染的區帶，而導致掃描不易顯示HbE帶，需要操作人員憑經驗判斷，如經驗不足則易漏診。而毛細管電泳是利用415 nm波長直接檢測各組分的百分比，不需要染色，不會將HbE和HbA2發生重疊而影響結果，所以不會出現檢測不出而導致漏診的情況。(2)本研究還發現全自動毛細管電泳檢出的3例 HbCS中瓊脂糖凝膠電泳僅能檢出2例,表明毛細管電泳對微量的異常血紅蛋白檢出率更高，定量更準確，在檢測各種異常血紅蛋白比瓊脂糖凝膠電泳更具明顯優勢。另外瓊脂糖凝膠電泳對HbF＜2.0%的HbF無法定量，只能掃描出HbA+HbF的量，這與陳星等[10]報告的結果基本相符。而全自動毛細管電泳則能直接檢測出HbF的準確百分比。毛細管電泳可直觀顯示HbF、HbCS、HbE的異常區帶，對HbF、HbE、HbCS等分辨力較高，可很好地檢測出這些異常Hb含量，并能夠直接檢測出準確百分比。國外已有毛細管電泳技術應用于診斷地中海貧血的研究報導[11-14],由此可見毛細管電泳在靈敏、快速、準確等方面具有明顯優勢。

本研究結果顯示兩種電泳方法篩查β地貧表型陽性的靈敏度和特異度都較高，但毛細管電泳系統檢測β地貧表型陽性符合率高于瓊脂糖血紅蛋白電泳，可見在地貧篩查中毛細管電泳是一種敏感度和精確度更高的分析方法。地中海貧血的篩查關系到本地區人口出生素質,目前在歐洲的一些地區，β-地中海貧血的產前篩查及產前診斷已作為常規項目開展，極大地減少了當地地中海貧血患兒的出生。我院自開展地中海貧血篩查后也幾乎沒有重度地中海貧血兒的出生，說明只要重視地中海貧血的產前篩查及產前診斷，可以大大減少重度地中海貧血患兒的出生。堅信不久的將來遺傳病兒一定能有效控制，我國人口質量將得到相應的提高。

[1]莫鳳明,伍德榮,何玉強.全自動電泳分析系統在地中海貧血篩查中的應用價值[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(5):472－474.

[2]梁華銘,黎金美.全自動毛細管蛋白電泳系統在地中海貧血篩查中的應用[J].中國醫學創新,2010,7(14):41－42．

[3]曾華,張智賢,倪李佳,等.網織紅細胞血紅蛋白含量在β-地中海貧血和缺鐵性貧血病人中的變化研究 [J].實驗與檢驗醫學,2013,31(3):205－207.

[4]Han L,Li J,Liu ZY,et al.Use of capillary electrophoresis to determine hemoglobin A2 in heathy adults andα-andβ-thalassemia carriers[J].Chinese JGenetic,2003,20(5):421－424.

[5]Lithanatudom P,Wannatung T,Leecharoenkiat A.Enhanced activation of autophagy inβ-thalassemia/Hb E erythroblasts during erythropoiesis[J].Ann Hematol,2011,90(7):747-758.

[6]Karimi M,Haghpanah S,Farhadi A.Genotype-phenotype relationship of patients with b-thalassemia taking hydroxyurea:a 13-year experience in Iran[J].Int JHematol,2012,95(1):51－56.

[7]Sihvonen LM,Toivonen S,Haukka K,et al.Multilocus variablenumber tandem-repeat analysis,pulsed-field gel electrophoresis,and antimicrobial susceptibility patterns in discrimination of sporadic and outbreak-related strains of Yersinia enterocolitica[J].Microbiology,2011,11(1):42－52.

[8]Tabesh H,Shekarchizadeh A,Mahzouni P.An intracranial extramedullary hematopoiesis in a 34-year-old man with beta thalassemia:a case report[J].JMed Case Rep,2011,5(1):580－584.

[9]黃鈺君,區小冰,張力,等.廣州地區兒童地中海貧血的發生率及基因檢測結果分析[J].臨床血液學雜志,2006,19(6):355－357,361．

[10]陳星,盧業成,初德強,等.全自動毛細管電泳與瓊脂糖電泳檢測血紅蛋白的比較[J].廣東醫學,2009,30(5):778－780.

[11]童順桃,雷慧中,周秀琴,等.清遠地區10年間胎兒、新生兒地中海貧血篩查診斷研究[J].現代預防醫學,2006,33(6):891－892．

[12]Li D,Liao C,Li J,et a1.Prenatal diagnosis ofβ-thalassemia in Southern China[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2006,128(1-2):81－85.

[13]李茹,廖燦,李東至,等.高分辨熔解曲線分析技術檢測中國人常見β地中海貧血基因突變中國[J].優生與遺傳雜志,2011,19(7):19－27.

[14]田鸞英,高武紅,謝雨芳,等.應用血液學指標診斷新生兒地中海貧血[J].中國當代兒科雜志,2005,7(1):63－64．