萍鄉地區孕婦產前地中海貧血篩查及基因診斷

劉紅宇，王繁，甘建玲，何蓉，鄧思媛，歐陽寧

(萍鄉市婦幼保健院生殖遺傳研究室，江西 萍鄉337055)

地中海貧血(thalassemia簡稱地貧)是人體珠蛋白基因缺失或突變而引起的一種遺傳性溶血性貧血，是我國南方最常見的遺傳性疾病[1，2]。在我國常見于廣西、海南、廣東、福建、香港、臺灣、云南、貴州、四川等地區。地貧目前尚無確切有效的治療方法，重型α-地貧多為死胎且孕婦并發妊娠高血壓綜合征，重型β-地貧需要終身依賴輸血和使用祛鐵劑，而中間型α和β地貧患者多無勞動能力或勞動力下降[3,4]，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。因此，采用紅細胞平均體積MCV(mean corpuscular volume),平均紅細胞血紅蛋白量MCH(mean corpuscular hemoglobin)和血紅蛋白電泳對孕婦進行地中海貧血篩查，缺口聚合酶鏈反應(Gap-PCR)法、聚合酶鏈反應－反向斑點雜交法(PCR-RDB)對高危胎兒進行產前基因診斷進行基因檢測。是預防重型地中海貧血患兒出生的重要措施和方法[5]。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2013年10月至2014年1月在我院婦保科產檢的孕婦及其丈夫共1345例，同時進行血常規和血紅蛋白電泳分析，并對164例地貧表型陽性者進行基因診斷。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 MCV和MCH測定 采用日本希森美康Xi800全自動血細胞分析儀及其配套的稀釋液和溶血素試劑測定，實驗前嚴格按照操作規程進行質控，標本為2ml EDTA-K2靜脈抗凝血。

1.2.2 血紅蛋白電泳分析 采用法國Sebia公司的全自動血紅蛋白電泳儀和按照配套的說明書進行操作。

1.3 地貧表型陽性診斷標準

1.3.1 α地貧表型篩查陽性 MCV<80 f1[6]，MCH<27pg，Hb A2<2.5%，Hb F<2%，其中一項陽性者。

1.3.2 β地貧表型篩查陽性 MCV<80f1，MCH<27pg，Hb A2>3.5%，Hb F>2%，其中一項陽性者。 對α或β地貧表型篩查陽性患者，重新抽取2ml EDTA-K2靜脈抗凝血做基因診斷。

1.4 檢測方法 地中海貧血的基因診斷α和β地貧試劑盒由亞能生物技術 (深圳)有限公司提供。PCR擴增儀為HEMA9600。

1.4.1 α地貧基因缺失型診斷采用Gap-PCR法檢測-αSEA，-α3.7和-α4.2三種α珠蛋白基因常見缺失型。α地貧點突變型診斷采用PCR斑點反向雜交法 (PCR-RDB)檢測三種點突變型，包括Hb WS:CD122(CAC→CAG),Hb QS:CD125(CTG→CCG),Hb CS:CD142(TAA→CAA)。

1.4.2 β地貧基因突變型采用PCR-RDB檢測17種β常見突變型 CD41-42(-TTCT)，IVS2nt654(C→T)，-28(A→G)，CD17(A→T)，CD71-72(+A)，-29(A→G)，βE(GAG→AAG)，CD43(G→T)，CD27/28(+C)，CD14-15(+G)，CD31(-C) ，-32(C→A) ，-30(T→C)，IVS-Ⅰ-5(G→C)，CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]，Int(ATG→AGG)。

2 結果

2.1 地貧表型陽性檢出率 在1345例病人中檢出地貧表型陽性者共164例，陽性率占12.19%。其中α地貧表型陽性者73例，占44.51%，β地貧表型陽性者91例，占55.49%。

2.2 地中海貧血基因診斷的確診例數 164例表型陽性的孕婦及其丈夫經基因診斷后，確診為地貧患者58例，其中α地貧18例，β地貧40例。

2.3 地中海貧血基因診斷的確診率中α和β各型所占比例 在18例α地貧中--αSEA/αα雜合子16例，占 88.89%，-α3.7/αα 地貧雜合子 0例，占 0%，-α4.2/αα地貧雜合子2例，占11.11%，見表1。

表1 α地貧雜合子基因型(%)

在40例β地貧中CD41-42雜合子15例，IVS2nt654雜合子10例，CD17雜合子6例，-28(A→G)6例，CD71-72(+A)2例，-29(A→G)1例，這40例β地貧患者，共有6種類型β珠蛋白基因突變發生，見表2。

表2 β珠蛋白基因突變構成比(%)

3 討論

地中海貧血分布于世界許多地區，東南亞是高發區之一，其中中國以廣東、廣西、四川、海南多見，常見的類型α地貧和β地貧，據現有流行病學調查資料顯示，以上地區人群中α地貧發生率高達4～15%；β地貧約1～6%。地貧危害最嚴重的臨床類型是Hb Bart’s胎兒水腫綜合征、重型β地貧、中間型β地貧和血紅蛋白H病。

3.1 萍鄉地區地中海貧血的篩查 在萍鄉地區1345例篩查夫婦中，地貧表型陽性檢出率為12.19% ，其中α地貧表型陽性檢出率為44.51%，β地貧表型的陽性檢出率為55.49%，在我院的產檢人群當中，血常規的MCV和MCH常作為地貧篩查指標，表型陽性者再進行血紅蛋白電泳分析以定量檢測Hb A，Hb A2和Hb F，電泳陽性者再進行基因確診實驗，以減少漏診的發生。

3.2 萍鄉地區地中海貧血的基因診斷 經α基因缺失型分析后，在萍鄉市的孕婦及其丈夫中，東南亞缺失型--αSEA/αα占主導地位，基因構成比占88.89%，-α4.2/αα 地貧，即左側缺失占 11.11%，右側缺失很少出現。說明在中國南方地區比如江西省萍鄉地區α地貧缺失型主要是東南亞型占大部分，這與有關的研究報道結果相一致[7]。1996年杜傳書等人總結了中國人β地貧基因突變頻率的高低順序如下CD41-42(-TCCT)占41.6%，IVS2nt654(C→T)占 21.8%，CD17(A→T)占 18%，β-28(A→G)占 8%，CD71/72(+A)占 3.9%，β-29(A→G)占 1.2%[8]。本文在檢測出6種基因突變類型和構成比，大致與之相同。

3.3 萍鄉地區地中海貧血各型的分布特點及其結論 迄今為止，中國人中共發現了7種地貧缺失基因， 比較常見的有以下三種：-αSEA/αα，-α4.2/αα，-α3.7/αα。在萍鄉地區的1345例產婦及丈夫中，主要是 --αSEA/αα(88.89%)，很少部分為-α4.2/αα(11.11%)。α地貧突變型的6例患者中，無一例異常。說明，萍鄉地區α地貧主要以缺失型為主，突變型比較罕見。β地貧主要是突變所導致的，目前中國人群主要有34種突變，亞能生物檢測的17種突變類型包括了常見的突變類型。在6例篩查結果顯示α和β復合型患者中，無一例是α和β同時存在的。因而防治地貧的主要措施是進行篩查，并通過婚前、孕前或產前篩查出靜止型或輕型地貧夫婦，對于重型地貧高危胎兒進行產前基因診斷，阻止該病重癥患兒出生是目前國際公認的首選預防對策[9,10]。

[1]Higgs DR,Ayyub H,Chong SS.The-THAI and-FIL determinants of a thalassemia in Taiwan[J].Hematology,1999,60(1):80-85.

[2]楊艷.地中海貧血篩查及基因檢測結果分析[J].中國臨床新醫學,2012,5(12):1159-1161.

[3]張俊武,龍桂芳．血紅蛋白與血紅蛋白病[M].南寧:廣西科學技術出版社,2003:204-235．

[4]Cappellini MD,Cohen A,Eleftheriou A,et al.Guidelines for the dinical management of thalassemia[M].Nicoeia,Cyprus:The Jassaemia International Federation,2007:18-30．

[5]Chong SS,Boehm CD,Higgs DR,et al.Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of a-thalassemia[J].Blood,2000,95(1):360-362.

[6]Chern SR,Chen CP.Molecular prenatal diagnosis of thalassemia in Taiwan[J].Gynecol Obstet,2000,69(11):103-106.

[7]張新華.廣西南寧市農村育齡人群地中海貧血篩查及基因型和血液學參數分析[J].中華流行學雜志,2006,27(9):769-772.

[8]杜傳書.地中海貧血研究的現狀與未來[J].中華醫學遺傳學雜志,1996,13(5):643.

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[10]曾華,張智賢,倪李佳,等.網織紅細胞血紅蛋白含量在β-地中海貧血和缺鐵性貧血病人中的變化研究 [J].實驗與檢驗醫學,2013,31(3):205-207.