凍干再水化血小板結構與功能研究

徐晶，張瑩瑩，杜忻，陳火玲，楊南，張曉麗，尹金鳳

(1、南昌市血站，江西 南昌330025；2、南昌大學第四附屬醫院腎內科，江西 南昌330003)

血小板(platelet)是由骨髓巨核細胞產生并釋放于血液循環中的最小細胞,在止血和凝血過程中發揮著重要的作用[1]。由于血小板保質期較短，臨床輸注需求量大，加之臨床輸注需求時間的不確定性，造成了血小板過期浪費和臨床供不應求的兩難尷尬局面[2]。目前國內血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為5d。此外血小板還可深低溫冰凍保存，但這種方法的保存效果和臨床療效不確切[3，4]。冷凍干燥技術已廣泛應用于各種生物材料的保存，凍干制品具有常溫下保存、性能穩定、便于運輸的特點[5]。本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測其凍干再水化后凝血功能的變化，為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 血小板來源 實驗組選擇體檢合格，一周內未服用阿司匹林等抗血小板藥物的自愿獻血者，用血細胞分離機單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存5d過期；對照組選擇新鮮機采血小板。

1.1.2 主要試劑和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經科宏達生物技術有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)；血小板聚集誘導劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS公司)；海藻糖加載緩沖液(含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8)；凍干保護劑(含 20%海藻糖，1%牛血清白蛋白，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復水溶液為PBS緩沖液和蒸餾水以3:1比例混合制成。以上試劑和溶液均在有效期內。

1.2 主要儀器 冷凍干燥機(LabConco，美國)；恒溫振蕩水浴(Bellco Glass，美國)；流式細胞儀(FACSCalibur，BD，美國)；血球計數儀(CELL－DYN 1700，Abbott，美國)；血小板聚集儀(APACT-2 型)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血小板的凍干保存 血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中，將上述懸浮液轉移進入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化4h。將孵化后的血小板懸浮液800g離心3min。去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護液打散重懸，使用血球計數儀進行計數，調節血小板在凍干保護液中的濃度為1×109個/ml。將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。將血小板凍干懸液先以20℃/min的速率凍結至-40℃，預凍2h后，再以1.5℃/min對擱板升溫至-30℃，退火0.5h，然后進入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件20h，最后以0.2℃/min的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件10h直至凍干結束。凍干的血小板密封保存在室溫。

1.3.2 凍干血小板的水化 將PBS緩沖液和蒸餾水以3:1的比例混合制成血小板凍干復水液，將1ml復水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品完全溶解于復水溶液中[6]。

1.3.3 檢測血小板回收率 用血球計數儀分別對凍干前和凍干再水化后的血小板計數，計算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計數/凍干前血小板計數×100%。

1.3.4 檢測血小板穩定性 凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計數儀測定血小板回收率。

1.3.5 血小板形態及超微結構觀察 用掃描電鏡觀察血小板的形態；分別以戊二醛固定、脫水、環氧樹脂包埋后制作超薄切片，用透射電鏡觀察血小板超微結構變化。

1.3.6 血小板聚集反應檢測 將凍干血小板復水后轉入離心管中進行洗滌以去除細胞外保護劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板，調整血小板濃度為(0.2～0.3)×1012/L。用APACT-2型血小板聚集儀檢測凍干再水化后血小板對四種同濃度誘導劑—凝血酶、膠原、ADP和瑞斯托霉素的聚集反應。

1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測 用三色流式細胞儀分別檢測凍干再水化血小板表面激活指標CD62p和PAC-1的表達，經凝血酶激活后測定CD62p和PAC-1的再表達。再表達率=凝血酶處理后表達率-血小板表達率

2 結果

2.1 血小板回收率及穩定性 實驗組和對照組間血小板計數有統計學意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為49.36%，見表1；凍干再水化血小板穩定性隨血小板放置時間的延長，血小板回收率逐漸下降，見圖1。

表1 實驗組與對照組血小板計數均數比較

圖1 血小板放置不同時間點的回收率

2.2 血小板形態及超微結構 掃描電鏡顯示新鮮血小板透光性較強，形態呈圓形或橢圓形，邊緣光滑，而凍干再水化血小板透光性較弱，血小板變形，見圖2A和B。透射電鏡顯示新鮮血小板著色較深，α顆粒、致密顆粒、過氧化酶顆粒等分散、清晰，而凍干再水化血小板著色較淺，致密顆粒及α顆粒不夠清晰，且數目少于對照組，見圖2C和D。

圖2 實驗組和對照組血小板形態及超微結構

2.3 聚集反應 實驗組和對照組間血小板同濃度誘導劑下的最大聚集率均有統計學意義 (P<0.05)，實驗組血小板對凝血酶、膠原、ADP和瑞斯托霉素的聚集功能較對照組均出現下降，見表2。

表2 實驗組與對照組血小板最大聚集率(%)

2.4 血小板表面糖蛋白 實驗組CD62p表達率和再表達率分別為50.25%、94.27%，均顯著高于對照組的8.12%、78.43%(P<0.05)；凝血酶作用后CD62p再表達率為44.02%，顯著低于對照組70.31%(P<0.05)。實驗組PAC-1表達率為3.85%，與對照組相比較無顯著性差異 (P>0.05)，PAC-1再表達率為42.75%，顯著低于對照組67.29%(P<0.05)，凝血酶作用后PAC-1再表達率為38.90%，顯著低于對照組 65.28%(P<0.05)，見表 3。

表3 實驗組與對照組CD62p和PAC-1的表達(%)

3 討論

血小板數目減少或功能不全所致出血性疾患的預防和治療，臨床多采用輸注血小板制劑。血小板保存技術的缺陷是血小板過期浪費和臨床供不應求的兩難處境的主要原因，因此，研究出一種能長期、高效、安全和方便的血小板保存方法一直是國內外輸血工作者關注的熱點和難題[7]。

將過期的血小板再利用及血小板的凍干保存有著廣闊的應用前景。本研究顯示凍干再水化的過期血小板回收率及穩定性較差，說明凍干和再水化過程對血小板功能造成一定影響，應進一步改進凍干保存時擱板溫度，復水液組分和比例，以及增加預復水步驟[8，9]。透射電鏡下新鮮血小板著色相對較深，可能為新鮮血小板生物活性較高或膜通透性相對較高，因而有較強吸附染料的能力。CD62p和PAC-1分別為血小板表面活化晚期標志物和活化早期的標志物，結果顯示過期血小板對凝血酶、ADP、膠原及瑞斯托霉素的最大聚集率明顯小于新鮮血小板，凝血酶作用后CD62p和PAC-1的再表達率低于新鮮血小板，說明過期以及凍干和再水化過程對血小板凝血功能有影響，但凍干再水化的過期血小板仍具有一定的存活能力和功能活性，因此選擇血小板進行冷凍干燥保存是血小板長期保存切實可行的方法，為新鮮血小板冷凍干燥保存提供理論依據。但對該方法保存血小板的回收率、穩定性以及凝血功能等還需做進一步研究與改進，以達到臨床應用的要求。

[1]王捷熙,楊超,王艷,等.小分子糖負載血小板+凍干保護劑混合懸液的相變點測定與屏蔽實驗研究[J].中國輸血雜志,2010,5(23):338-340.

[2]王捷熙,韓穎,楊超,等.生物化學穩定法冰凍干燥血小板制劑的功能研究[J].中國輸血雜志,2010,5(23):341-343.

[3]池春燕,林力紅.外科DIC患者輸注冷沉淀凝血因子的療效觀察[J].實驗與檢驗醫學,2014,32(1):53-56.

[4]鄧日富.臨床用血情況分析[J].實驗與檢驗醫學,2013,31(4):388-389.

[5]徐祥蓮,王麗,徐晶,楊娟,等.2008年至2011年南昌市地區捐獻機采血小板情況分析[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(6):615-616.

[6]周俊,張長虹,劉景漢,等.凍干血小板功能的體外評價[J].中國輸血雜志,2008,10(21):774-777.

[7]Hoshi R,Murata S,Malsuo R,et al.Freeze-dried platelets promote hepatocyte proliferation in mice[J].Cryobiology,2007,55(3):255-260.

[8]劉瑛,許先國,洪小珍,等.血小板凍干再水化的形態結構與凋亡[J].基礎醫學與臨床,2008,11(28):1169-1173.

[9]戚新,孟跟東,王薇.冷凍保存血小板質量評估的主要指標[J].中國誤診學雜志,2008,26(8):6376-6377.