橡膠樹體胚發生過程中的生理生化特性

張慧君 華玉偉 黃天帶 黃華孫

摘 要 以巴西橡膠樹花藥為外植體，研究了巴西橡膠樹花藥體胚發生過程中抗氧化酶活性和某些生理參數的變化。結果表明，橡膠樹花藥體胚發生過程中，SOD活性變化表現在培養30 d達到最高值，而后下降平緩；丙二醛（MDA）含量在第60天達到最高。生理參數的變化表現為可溶性蛋白含量0 d含量最高，可溶性糖的含量在50 d達到最高，據此認為，SOD和MDA對橡膠樹花藥體胚的誘導起主導作用，可溶性蛋白含量與不定芽的發生密切相關。

關鍵詞 巴西橡膠樹 ；體胚發生 ；抗氧化酶活性 ；可溶性蛋白含量

分類號 S794.1

植物離體培養過程中體細胞胚胎的發生，是由愈傷組織先形成胚狀體，再由胚狀體發育成完整植株，其生理生化特征的改變，是植物外植體外部形態特征的外部反映，這些變化決定著外植體發育的方向[1]。本研究以巴西橡膠樹花藥為外植體，在適合的培養基中誘導產生體胚，在體胚不同發育時期測定其生理生化指標，以探索其生理生化特性，對于橡膠樹體細胞胚發生研究具有重要意義。

SOD是重要的抗氧化酶，其活性的高低能直接反映植物清除活性氧能力的大小[2]。SOD主要清除超氧化物陰離子自由基，POD和CAT主要清除H2O2，三種酶相互作用可以有效清除活性氧，并防止膜脂過氧化。許多學者研究表明，外植體抗氧化酶活性的變化與外植體細胞的分化有直接的關系[3-6]。細胞膜脂過氧化水平的程度，MDA是重要衡量指標，又是一種能強烈的與細胞內各種成分發生反應的主要物質，因而引起酶和膜的嚴重損傷，膜電阻及膜的流動性降低，最終導致了膜結構及生理完整性的破壞[7]。當活性氧積累超過抗氧化酶系統的清除能力時，導致活性氧及丙二醛（MDA）積累，導致膜透性增大[8-9]。

本研究以巴西橡膠樹花藥體胚的誘導發生為基礎進行組織培養，研究了巴西橡膠樹花藥體胚發生過程中外植體內部抗氧化酶活性和MDA含量的變化趨勢，旨在探討橡膠樹體胚發生的生理生化機理，為巴西橡膠樹花藥再生體系的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料以巴西橡膠樹優良無性系熱研 7-33-97花藥為試材，花藥培養方法參照Hua等[10]的方法。

1.2 方法

1.2.1 生理參數測定

分別準確稱取花藥愈傷在體胚誘導培養基上培養0、10、20、30、40、50和60 d新鮮外植體材料0.2 g，在4℃預冷的研缽中，加入5 mL PBS緩沖液（pH7.8）研磨，使最終添加量為5 mL。10 000 r/min離心10 min，取上清液冷藏于冰盒中，用于各項生理指標的測定。重復3次。

采用NBT光化還原法測定SOD活性[11]。以SOD抑制NBT的光化學還原50%時的酶用量為一個酶活性單位。

采用考馬斯亮蘭G-250法測定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白做標準曲線，計算各樣品的蛋白質濃度。采用蒽酮法測定可溶性糖[12]。采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量，參照張志良[13]的方法，計算MDA含量。

1.2.2 數據分析

數據采用Excel 2007軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 巴西橡膠樹花藥體胚發生過程中SOD活性的變化

SOD（超氧化物歧化酶）是需氧生物中普遍存在的一種酶，它能夠防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害。從圖1可知，即在培養初期，外植體超氧化物歧化酶（SOD）活性最低，第30天出現最高峰，由于此階段愈傷組織開始形成體胚，體積增大，外植體對營養物質的需求逐漸增加而使SOD活性呈上升趨勢[14]。而此時正是心形體胚生長的時期，這說明SOD活性升高對早期子葉胚的發生有促進作用。在培養的40～60 d，外植體組織處于旺盛的生長階段，SOD活性逐漸下降。

2.2 MDA含量的變化

丙二醛（MDA）含量能反應細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標之一[15]。在巴西橡膠樹花藥體胚的誘導過程中，MDA含量變化較大（圖2）。在第60天達到最高，這可能也與其再生產生不定芽相關，但MDA含量20～50 d總體差異不是很大。

2.3 可溶性蛋白含量的變化

隨著愈傷組織的進一步發育，其可溶性蛋白含量也發生一定的變化。由圖3可以看出，可溶性蛋白含量最高值出現在0 d，隨后下降。在培養的20、30 d出現小高峰。可溶性蛋白含量峰值的高低及出現時間的不同，與體胚的生長也有重要關系，在培養的初期，即愈傷時期，蛋白含量最高，之后隨著愈傷組織的生長而變化。

2.4 可溶性糖含量的變化

測定可溶性糖含量結果表明，在體胚發生階段，從0 d開始可溶性糖含量出現上升，但速度緩慢，在第50天達到含量最高，而后下降，而此時正是子葉胚時期。可見，子葉胚形成后，可溶性糖含量明顯下降。

3 討論

巴西橡膠樹花藥體胚的發生是一個極其復雜的過程，伴隨著一系列的外植體生理生化變化，這些變化在形態轉變之前已經發生。許多研究表明，SOD是植物體內氧代謝的關鍵酶，是細胞的一種保護酶和誘導酶[14]。本試驗研究結果表明，SOD活性的高峰在愈傷組織培養第30天出現，與關正君[15]、何夢玲[16]試驗結果相似。這可能是巴西橡膠樹愈傷組織初始階段形成過程中過多的氧自由基，SOD酶可用于清除這些自由基，致使代謝水平和呼吸作用增強。而后隨著花藥體胚的旺盛生長，多余的超氧自由基被還原為H2O，不斷減少的超氧自由基，使得SOD活性變化較為緩慢，并且呈現出下降趨勢。由于外植體對培養環境的適應，所以受到外部環境條件的影響，SOD酶活性也在發生變化，這也是在出現了高峰后伴隨酶活性下降的原因。

可溶性蛋白質含量的高低可以間接反映出細胞各種代謝活動的強弱，在植物組織培養中中起著重要的作用[4]。本研究發現，在花藥外植體培養30 d后，外植體內可溶性蛋白質含量呈下降趨勢，并且可溶性蛋白呈現最高值，這可能是由于細胞內原有的可溶性蛋白質轉變為細胞啟動時所需的物質，并且新的蛋白質還未合成。當細胞開始分裂增殖時，細胞內開始合成可溶性蛋白質，因此升高，30 d時，隨愈傷組織衰老時又降低。丙二醛（MDA）含量體現在培養60 d時最高，可見與子葉胚形成有關。

碳水化合物在植物體胚發生過程中起著重要的作用。本研究發現，可溶性糖含量培養前期含量緩慢上升，而培養50 d后，開始下降。表明可溶性糖含量與子葉胚形成關系密切。陳陸琴等[17]研究發現，合歡、金蓮花莖尖從愈傷組織分化出芽，在前12 d的培養中，糖含量呈現迅速增長的趨勢，而后糖含量逐漸下降。這可能是由于可溶性糖作為外植體分化細胞的碳骨架原料，愈傷組織增殖時，需要更高的糖來提供原料供應。

參考文獻

[1] 王 熊.激素對植物培養細胞生化的調節作用[J]. 細胞生物學，1983，3（5）：40-45.

[2] Fridovich I.The biology of oxygen radical，the supemxide radical is an agent of oxygen toxicity：superoxide dismutase provide an important defence[J]. Science， 1978， 201： 875-880.

[3] 崔凱榮，任紅旭，邢更生，等.枸杞組織培養中抗氧化酶活性與體細胞胚發生相關性的研究[J].蘭州大學學報（自然科學版），1998，34（3）：93-99.

[4] 王敬文，蔣 晶. 低溫馴化的黑荊樹懸浮培養細胞中可溶性蛋白含量變化[J]. 林業科學研究，1993，6（6）：661-665.

[5] 崔凱榮，王曉哲，陳 雄，等. 小麥體細胞胚發生中DNA、RNA和蛋白質的合成動態[J]. 核農學報，1997，11（4）：209-214.

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