海南野生疣柄魔芋組培快繁技術

潘登浪 曾憲海 鄒積鑫 周立軍　王軍 吳志祥 李文 林位夫

摘 要 為開發利用海南本地魔芋種質資源，以海南本地野生疣柄魔芋球莖頂芽為外植體，研究其組培快繁技術。結果表明：外植體消毒以在0.1% HgCl2溶液中浸泡20 min為宜；采用MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L培養基，較有利于從頂芽基部直接誘導出叢芽，且增殖系數較高，達4.37；而叢芽分切成單芽后，在MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L培養基上的生根率可達100%。

關鍵詞 海南 ；疣柄魔芋 ；組織培養 ；耐蔭植物

分類號 Q949.717.2

魔芋為天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus Blume）總稱，為多年生宿根草本植物[1]。魔芋塊莖經過加工，在食品、飼料、工業、醫藥保健方面有廣泛用途[2-6]，深受廣大人們的喜愛。中國魔芋有2 000多年的栽培歷史，而國外始于20世紀初。據目前數據分析，國內魔芋產品市場有20億元，日本年銷售6 000億日元，韓國、臺灣、歐美魔芋產品市場有60億～80億美元[4，7]。魔芋通過無性繁殖進行繁育，生產上一般采用小種芋或將大塊莖分切成小塊莖繁育種苗，用種量大、增殖系數低、周期長，并且在貯藏、播種中易感病腐爛，同時由于種芋為營養器官多年留種累積病原容易造成種質退化，嚴重限制了生產的發展和新品種的推廣。利用組培快繁技術可較好地解決這些難題，前人在魔芋組培快繁技術研究方面已有不少的報道[8-15]，但具有良好藥用[16-17]、食用[18]、飼用價值[3]的疣柄魔芋的組培技術未見相關報道。海南本地野生疣柄魔芋種質資源具有耐蔭、抗病、塊莖大（單個球莖可達9 kg）等特點。鑒于此，本研究采用海南本地野生疣柄魔芋的球莖頂芽為外植體，開展組培快繁研究，以期建立海南本地野生疣柄魔芋的組培快繁技術體系，為海南省魔芋產業的發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于海南省島內自然闊葉林下的野生疣柄魔芋，采用其塊莖頂芽作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 不同消毒時間對外植體的消毒效果

將新芽長1～2 cm的魔芋球莖清洗干凈，切取帶頂芽新生幼嫩組織，置于自來水下沖洗1 h，剝除外層老皮，再用清水沖洗1次后移植超凈工作臺上，按無菌操作規程對外植體進行消毒處理：外植體先用75%酒精浸泡30 s，再將其在0.1% HgCl2溶液中分別浸泡10、15、20、30 min，探索不同消毒時間對海南野生魔芋外植體消毒的效果。外植體經HgCl2浸泡后，用無菌水洗5次，再用無菌濾紙將外植體表面水分吸干，接種于A培養基上進行初代誘導培養。每處理接種20瓶，每瓶接種1塊外植體，每個處理重復3次。培養30 d后，觀察統計外植體的污染、死亡情況。

A培養基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP（聚乙烯吡咯烷酮）1 g/L，pH6；培養條件：接種后外植體放置在溫度（27±2）℃條件下暗培養10 d，再置于同等溫度條件下連續弱光（光照強度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d）培養。

1.2.2 不同濃度的6-BA對叢芽的增殖效果

將經0.1% HgCl2浸泡20 min滅菌和在A培養基上培養30 d獲得的無菌材料轉接到添加不同濃度6-BA的增殖培養基CK、B1、B2、B3，探索不同濃度的6-BA對魔芋叢芽增殖的影響。每處理接種10瓶，每瓶接種2個芽，重復3次。培養60 d后，觀察統計各處理對叢芽增殖的效果。

CK：MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7g/L，pH 6.0；B1：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0；B2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0；B3： MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0。接種后培養條件：溫度為（27±2）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.3 統計方法

數據采用Excel和SPSS軟件進行統計分析。相關計算公式如下：

污染率=污染外植體個數/接種外植體個數×100%

死亡率=死亡外植體個數/未污染外植體個數×100%

叢芽增殖系數=繼代培養后芽個數/原接種芽個數

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體消毒效果的影響

海南野生疣柄魔芋球莖（圖1）頂芽新生組織在0.1% HgCl2溶液中浸泡10～30 min，其不同消毒時間對外植體消毒效果不同。由表1可知，隨著消毒時間的延長，污染率降低，但死亡率升高。消毒10、15 min時，無外植體死亡，但污染率很高，分別為81.65%和70%；消毒30 min時，污染率低，僅為15%，但死亡率高達68.35%；消毒20 min時，外植體污染率為33.35%，死亡率為5%。綜合考慮污染率和死亡率的情況，以海南野生疣柄魔芋球莖頂芽新生組織為外植體，較理想的外植體消毒時間為20 min。另外，外植體在30 d的初代培養中，各處理均未產生側芽或叢芽，部分頂芽有所萌長，僅芽鱗片開裂，未長出葉片（見圖2）；各處理未出現外植體褐化現象。

2.2 不同濃度的6-BA對叢芽增殖的影響

將經0.1% HgCl2浸泡20 min滅菌和在A培養基上培養30 d獲得的無菌材料轉接到添加不同濃度6-BA的增殖培養基培養60 d，其叢芽增殖效果在0、1 mg/L差異不顯著，3、5 mg/L與其他濃度間存在顯著差異（見表2和圖3），6-BA濃度為0～5 mg/L時，隨著濃度的增大，增殖倍數先增大，在6-BA濃度達到3 mg/L時，增殖倍數最大為4.37，之后增殖倍數開始降低。6-BA濃度為5 mg/L時，增殖倍數為2.6，并且外植體長出愈傷組織。研究結果表明，6-BA濃度對海南野生疣柄魔芋球莖頂芽直接誘導叢芽效果明顯，其較佳培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0。

2.3 生根壯苗培養

將叢芽分切成單芽，接種于生根壯苗培養基（MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 6.0）中。培養條件：溫度為（27±2）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。生根壯苗培養20 d后，抽葉率和生根率均為100%（見圖4）。

2.4 煉苗移栽

將經生根壯苗培養獲得的具根、莖、葉組培苗移到室溫、500 lx自然光下，打開組培瓶蓋鍛煉3 d，然后移出組培瓶，用清水洗去粘附于植株上的培養基，移栽于花盆（12 cm×15 cm）中，移栽介質組分椰糠∶表土=2∶1。移栽0～15 d，用薄膜密閉保濕，控制濕度90%以上，光照強度小于5 000 lx，移栽7 d后，開始長出新根。移栽15 d后，可掀開保濕膜進行常規管護。移栽30 d后，調查移栽成活情況，其成活率為96%（見圖5）。

3 討論與結論

海南野生疣柄魔芋球莖頂芽通常生長在高溫高濕環境的土壤中，器官組織帶菌較多，消毒難度大，消毒時間短達不到滅菌效果，消毒時間長對外植體傷害大，綜合考慮后，外植體較為理想的消毒方法為：先經75%酒精浸泡30 s，再經0.1% HgCl2溶液浸泡20 min，最后用無菌水洗5次。 在本試驗中，海南野生疣柄魔芋球莖頂芽外植體初代誘導中基本未發現褐化現象，不同于白魔、花魔芋、紅魔芋外植體較易褐化[12，14-15]，可能是因為培養基中加入了PVP（聚乙烯吡咯烷酮），或海南野生疣柄魔芋球莖頂芽外植體本身多酚氧化物含量較少等，有待進一步研究。

植物激素對魔芋的生長發育起著非常重要的調節作用，適當的細胞分裂素與生長素比值有利于促進腋芽的分化與生長，比值過高或過低都不利于腋芽的分化和生長，本結果與胡悅等[9]對花魔芋的研究結果相一致。促進海南野生疣柄魔芋腋芽產生的適宜培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L。

本實驗初步建立了包括外植體消毒及其初代誘導、叢芽增殖、生根誘導、馴化移栽的海南疣柄魔芋組培快繁技術體系，達到了魔芋種苗的規模化生產技術水平，對推動海南省魔芋產業的發展具有積極意義。

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