多菌靈及其雜質和代謝物對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性
2014-11-14 00:01:01郇志博羅金輝
熱帶農業科學 2014年10期
郇志博 羅金輝
摘 要 分別使用土壤培養法和血細胞微核試驗測定多菌靈及其雜質（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性。結果表明：多菌靈、2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪和2-氨基苯并咪唑對赤子愛勝蚯蚓7 d的LC50分別為8.60、14.84、18.92和27.72 mg/kg干土，多菌靈對蚯蚓的毒性為中毒，其他3種化合物為低毒。微核試驗結果表明：多菌靈能明顯誘導赤子愛勝蚯蚓血細胞產生微核，并且隨著暴露劑量和暴露時間的延長微核率增加；其他3種物質在測定劑量和測定時間下，微核率與空白對照差異不顯著。
關鍵詞 多菌靈 ；2，3-二氨基酚嗪 ；2-氨基-3-羥基酚嗪 ；2-氨基苯并咪唑 ；急性毒性 ；遺傳毒性
分類號 X171.5
多菌靈是一種內吸性苯并咪唑類殺菌劑，常用于防治多種真菌性病害，如炭疽病、霜霉病、銹病、瘡痂病、褐斑病等，在果蔬、茶葉和觀賞植物上廣泛應用[1]。中國年產多菌靈原藥超過1萬 t，占中國殺菌劑總量的1/4[2]。截止2012年7月， 中國共有857家農藥廠登記各種多菌靈的單一及復配制劑，且多菌靈還是其他苯并咪唑類殺菌劑（如：苯菌靈、噻菌靈和托布津等）的活性成分和代謝產物[3]，多菌靈降解速度緩慢，在土壤中培養250 d后，仍會有5%～13%的多菌靈殘存于土壤中[4]，而且多菌靈在水果、蔬菜中殘留超標的情況也時有發生[5-6]。
2012年1月，美國可口可樂公司和百事公司的橙汁產品檢出極少量殺菌劑多菌靈，由于多菌靈可疑的損傷遺傳物質的作用，引起全球范圍的“果汁”恐慌[7]。2012年4月國際環保組織“綠色和平”調查北京、成都和海口的9個茶葉品牌，檢測結果發現18份茶葉有14份含有多菌靈等可能影響生育能力、胎兒發育或可能損害遺傳基因的殘留農藥[8]。
20世紀80年代就有關于多菌靈的毒性報道，至90年代，多菌靈已被世界衛生組織列為可疑的環境內分泌干擾物。多菌靈的大鼠急性經口LC50>15 000 mg/kg，經皮LC50>2 000 mg/kg，小鼠口服LC50為5 000 mg/kg，按中國農藥毒性分級標準屬于低毒殺菌劑[9]。但多菌靈是否具有遺傳毒性，眾說紛紜。有學者研究發現，長期大量喂食含多菌靈的飼料可以提高小鼠肝臟良、惡性腫瘤的發病率，且與給藥量有著明顯的劑量-反應關系；另一些學者卻研究發現，多菌靈可能不是一種致突變物，因為給大鼠喂食含1 000 mg/kg多菌靈的飼料4個月，結果顯示為陰性[9]。曹柳燕等[10]研究發現，多菌靈的致癌性與雜質2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）有關，通過改善多菌靈的生產工藝，可以減少雜質含量，降低多菌靈的遺傳毒性；于功昌等[9]認為，多菌靈的致癌性與其代謝轉化產物（2-氨基苯并咪唑）有關。因此，弄清多菌靈是否具有遺傳毒性以及其遺傳毒性與雜質和代謝物的關系，對保護消費者的健康和保障食品安全具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試動物和藥劑
赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）購自天津賈立明養殖公司，每條體重約200～300 mg，經實驗室預培養，環帶明顯、大小基本一致的健康成蚓，試驗前清腸24 h。
多菌靈、2，3-二氨基酚嗪（DAP）、2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）和2-氨基苯并咪唑標準品購自SIGMA公司。
1.1.2 試驗設備和條件
光學顯微鏡（YS100，尼康）；光照培養箱（HPG-280B，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）。
試驗用人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、68%石英砂和2%碳酸鈣組成，充分混勻后待用。
1.2 方法
1.2.1 急性毒性試驗
參照劉偉等[11]的研究方法，先做預試驗，求出各種化合物對蚯蚓7 d全致死的最低濃度和全存活的最高濃度，在此范圍內設置5個處理組，設立溶劑對照和空白對照，每個處理3個重復，每個重復10條蚯蚓。先將丙酮配制的系列濃度的化合物與10 g人工土壤混勻，待丙酮充分揮發后，再與490 g人工土壤充分混勻，調節水分，使其含水量約為30%，然后放入蚯蚓，置于2 L燒杯中，用塑料薄膜封口，并用解剖針在薄膜上扎孔，置（20±1）℃、濕度80%～85%的培養箱中，400～800 Lx光強連續光照，于第7天倒出瓶內土壤，記錄蚯蚓死亡數（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無反應則為死亡），及時清除死蚯蚓。根據蚯蚓7 d的死亡率，求出各個化合物對蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限。
1.2.2 微核試驗
根據急性毒性試驗各個化合物的LC50值，設置多菌靈試驗濃度為0.4、1.2、3.6 mg/kg干土；2，3-二氨基酚嗪濃度、2-氨基-3-羥基酚嗪濃度為0.6、1.8、5.4 mg/kg干土；2-氨基苯并咪唑濃度為0.8、2.4、7.2 mg/kg干土。設置空白（水）對照、陽性對照（絲裂霉素）0.4 mg/kg干土，染毒方法同急性毒性試驗方法，于處理后的第7、14、21天取出蚯蚓，制備血細胞涂片并進行顯微觀察，每個處理設3個重復，每個重復10條蚯蚓。
將染毒后的蚯蚓浸入蒸餾水中并逐滴加入濃度為95%酒精，使蚯蚓麻醉，然后用濾紙吸干多余液體，用小剪刀將蚯蚓的背部剪破后取血，迅速涂片，晾干，甲醇固定15 min，15% Giemsa染色液（用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，pH 6.8）染色15 min，用去離子水沖洗，電熱吹風吹干，400倍顯微鏡觀察。每個重復取2條蚯蚓，每條蚯蚓制備1張涂片，每張涂片觀察約500個血細胞，記錄微核細胞數目，計算微核率，觀察結果以千分率表示。微核判斷標準：位于有核血細胞胞漿中，與主核完全分開，呈圓形或橢圓形藍紫色顆粒，邊緣光滑，染色性質與主核一致，大小為主核的1/3以下[12]。
1.2.3 數據處理
根據不同濃度下的死亡率，使用軟件SPSS16.0的Probit模型計算各個化合物對蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限；微核率的結果表示為[平均值±標準偏差（SD）]，使用SPSS的單因素方差分析法分析不同濃度處理區組間差異，若差異明顯，用SPSS的最小顯著極差法（LSD）進行多重比較。
2 結果與討論
2.1 4種物質對蚯蚓的急性毒性
4種物質土壤染毒后蚯蚓的中毒癥狀類似：低濃度下，體色變暗，卷曲、僵硬，生殖環腫脹，高濃度處理后蚯蚓背部出現水泡、滲血現象，隨著中毒時間延長，高濃度處理組蚯蚓滲血現象嚴重，生殖環潰爛，體節延長，蚯蚓尾部有斷節現象。
蚯蚓是評價化學農藥安全性的一種重要的指示生物。目前中國劃定的農藥對蚯蚓毒性等級標準為高毒（LC50≤1 mg/kg干土），中毒（1 mg/kg干土
2.2 微核試驗
表2數據表明，隨著多菌靈濃度的升高，在相同的染毒時間內，蚯蚓血細胞的微核率顯著性升高。在同一濃度下，隨著染毒時間的延長，蚯蚓血細胞的微核率也有所提高（P<0.05），空白對照和陽性對照的試驗結果表明試驗數據可信。通過400倍的顯微鏡觀察，多菌靈誘導的蚯蚓血細胞微核清晰可見（圖1）。表2、3和4表明，多菌靈的2種雜質2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）和1種代謝物2-氨基苯并咪唑對蚯蚓血細胞微核的誘導作用與空白對照相比差異不顯著（P>0.05），而且隨著處理時間的延長，其微核率與空白對照相比差異也不顯著（P>0.05）。
3 結論
微核是細胞經輻射或化學藥物的作用后，在有絲分裂過程中形成的落后染色體、染色體橋、染色斷片、環狀染色體等在末期以后形成的1個或幾個規則的次核。一般產生的微核數與外界誘變因子的強弱成正比，所以可用微核出現的千分率來評價污染物對生物遺傳物質影響的程度，微核率已被國際誘變劑、致癌劑保護委員會推薦為檢查致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理方法之一[13]。
至于多菌靈誘導產生微核的機理，黎杰強等[13]通過蠶豆微核試驗發現，多菌靈一是通過干擾有絲分裂過程中紡錘體的形成，引起細胞不能正常有絲分裂，致使一到數條染色體在有絲分裂后期不能進入細胞核，而單獨留在細胞質中形成微核；二是多菌靈直接導致染色體斷裂和粘連。吳麗明等[14]通過對雄性小鼠生殖細胞的染色體觀察發現，多菌靈能誘發小鼠精母細胞染色體畸變率增加，畸變的類型有形成染色體斷片、環狀四價體和鏈狀四價體等。
本研究表明：多菌靈對赤子愛勝蚯蚓的毒性等級為中毒，雜質（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對赤子愛勝蚯蚓為低毒；多菌靈能明顯誘導赤子愛勝蚯蚓血細胞產生微核，并且隨著暴露劑量和暴露時間的延長微核率增加，因此多菌靈是一種潛在的誘變劑和致癌劑；建議目前的食品安全風險評估在關注農藥殘留的急性毒性的同時，加強關注多菌靈類似農藥的誘變作用和致癌作用；另外雜質（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對蚯蚓血細胞染色體畸變的誘導作用不明顯，因此多菌靈的致癌致畸作用可能與這幾種物質無關。
參考文獻
[1] 張戈壁，陽廷密，王明召. 苯菌靈對香蕉灰紋病菌室內毒力測定[J]. 廣西園藝，2004，15（2）：25-26.
[2] 宋遠超，于功昌，王筱芬. 多菌靈生殖毒性研究進展[J]. 中國職業醫學，2010，37（6）：505-507.
[3] 郎 漫，李 平，蔡祖聰. 多菌靈在土壤中的降解及其生態環境效應[J]. 農藥，2012，51（1）：8-10.
[4] 花日茂，岳永德. 苯并咪唑類殺菌劑在環境中的降解代謝[J]. 安徽農學院學報，1991，18（1）：84-86.
[5] 蔡 興，范寧云，孫 錦. 多菌靈在三種蔬菜中的降解研究[J]. 甘肅科技，2009，25（3）：62-63.
[6] 陳銘學，牟仁祥，吳 俐. 反相離子對高效液相色譜法測定蔬菜中多菌靈殘留量[J]. 分析試驗室，2005，24（11）：54-56.
[7] 任海軍.百事“純果樂”橙汁中發現極少量殺菌劑[EB/OL]. http：//news.xinhuanet.com/world/2012-01/15/c_111439597.htm， 2012-01-15/2014-09-26.
[8] 杭州網. 調查報告顯示多款茶葉農藥殘留超標[EB/OL]. http：//news.hangzhou.com.cn/gnxw/content/2012-04/
12/content_4148249.htm， 2012-04-12/2014-09-26.
[9] 于功昌，王筱芬. 多菌靈的毒理學研究進展[J]. 職業與健康，2008，24（17）：1 834-1 835.
[10] 曹柳燕，陳關喜，馮建躍，等. 多菌靈原藥中2 個酚嗪類雜質含量的高效液相色譜法測定[J]. 分析測試學報，2008，27 （4）：412-414.
[11] 劉 偉，朱魯生，王 軍，等. 毒死蜱、馬拉硫磷和氰戊菊酯對赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）的急性毒性[J]. 生態毒理學報，2009（4）：597-601.
[12] 陳志偉，李興華. 銅鎘單一及復合污染對蚯蚓血細胞微核的誘導[J]. 農業環境科學學報，2006，25（5）：1 193-1 197.
[13] 黎杰強，黃海琳，李丹霞，等. 3種常用農藥對蠶豆根尖細胞的遺傳毒性[J]. 華南師范大學學報，2008（1）：112-117.
[14] 吳麗明，黃伯俊. 多菌靈對雄性小鼠生殖細胞染色體畸變的影響[J]. 衛生毒理學雜志，1993，7（1）：52-53.
