腦膠質(zhì)瘤IDH1基因突變與核干細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性分析

壽記新 管海博 程 森

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

膠質(zhì)瘤（glioma）又稱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，多見于成年人，是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，核干細(xì)胞因子（核－stemin，NS）是一種對(duì)細(xì)胞繼續(xù)增殖起關(guān)鍵作用的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白［1］，且發(fā)現(xiàn) NS蛋白在多種腫瘤組織中高表達(dá)［2－3］。異檸檬酸脫氫酶（IDH）是一種限速酶，可為細(xì)胞新陳代謝供應(yīng)能量、合成前體物質(zhì)［4］。而近幾年，Parsons等［5］通過對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了其突變位點(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)此突變與生存率的關(guān)系，為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤的治療打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本文主要分析膠質(zhì)瘤中IDH1基因突變與膠質(zhì)瘤NS表達(dá)的相關(guān)性，旨在進(jìn)一步闡明二者與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料選取我院神經(jīng)外科2010－03—2013－03手術(shù)切除的部分膠質(zhì)瘤標(biāo)本58例，其中原發(fā)病例29例為原發(fā)組，按照WHO（2000）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)，Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ級(jí)11例，Ⅳ級(jí)8例。復(fù)發(fā)病例29例為復(fù)發(fā)組，Ⅱ級(jí)6例，Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)13例。用相應(yīng)方法分別檢測(cè)樣本的IDH1基因多態(tài)性變化與NS表達(dá)；所有標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)師提供。

1.2 PCR檢測(cè)IDH1基因多態(tài)性

1.2.1 DNA：用上海酶聯(lián)試劑盒檢測(cè)測(cè)定中心DNA提取試劑盒，按說明書提取DNA，核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成：序列為：5＇－AGCTATGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG 和 3＇－CGACTTGCCACCAACGACCAAGTC。合成步驟：95℃預(yù)變性10～12 min；用 Touchdown PCR，95℃變性55s，56℃退火1min，72℃延伸1～2min，共循環(huán)15次；94℃變性50s，58℃退火1 min，72℃延伸1min，共循環(huán)25次，最后于72℃延伸10min。

1.2.3 測(cè)序反應(yīng)后純化及基因測(cè)序：PCR產(chǎn)物用北京方程科技有限公司提供PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物經(jīng)北京美科美生物科技有限公司提供的DNA自動(dòng)測(cè)序儀（ABI3730型遺傳分析儀）電泳。

1.2.4 結(jié)果分析：用DNA序列分析5.1自動(dòng)分析原始測(cè)序數(shù)據(jù)，樣本序列采用相應(yīng)DNA軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比，察看樣品基因序列的變化。

1.3 NS表達(dá)檢測(cè)首先標(biāo)本組織經(jīng)生理鹽水沖刷干凈、固定、脫水處置，其次經(jīng)二甲苯透后，石蠟包埋，做成4μm厚度切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NS蛋白。鼠抗羊IgG購(gòu)自鄭州百基生物科技有限公司，SABC免疫組化染色試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行使用，最后鏡檢。用PBS作為陰性對(duì)照，而陽(yáng)性對(duì)照采用NS蛋白陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌組織切片。

2 結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤中IDHl的突變情況

2.1.1 直接基因測(cè)序：58例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，共30例發(fā)生IDHl突變，突變類型均為R132H型。原發(fā)標(biāo)本組和復(fù)發(fā)組發(fā)生IDH1基因突變率見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析：在原發(fā)組中Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤發(fā)生突變率低于Ⅱ、Ⅲ 級(jí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)發(fā)標(biāo)本組中Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤發(fā)生率高于Ⅱ、Ⅲ級(jí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 膠質(zhì)瘤標(biāo)本中不同病例級(jí)別IDH1基因突變率比較 ［n（%）］

2.1.2 原發(fā)膠質(zhì)瘤中IDHl突變與NS表達(dá)的關(guān)系：NS檢測(cè)顯示不同WHO分級(jí)的原發(fā)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中NS陽(yáng)性的表達(dá)率分別為Ⅱ級(jí)（30.00±7.50）%、Ⅲ級(jí)（45.45±8.34）%和IV級(jí)（62.50±14.01）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析表明NS陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的病理分級(jí)有正相關(guān)性（r＝0.528，P＝0.006）。伴IDHl突變的腫瘤標(biāo)本 NS陽(yáng)性表達(dá)率（36.28±13.17）%較IDHl野生型NS表達(dá)率（45.34±4.81）%增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.082，P＝0.027）。

2.1.3 復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中IDHl突變與NS表達(dá)的關(guān)系：NS檢測(cè)顯示不同WHO分級(jí)的復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中NS陽(yáng)性的表達(dá)率分別為Ⅱ級(jí)（50.00±16.23）%、Ⅲ級(jí)（70.00±13.48）%和IV級(jí)（84.61±9.52）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析表明NS陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的病理分級(jí)有正相關(guān)性（r＝0.614，P＝0.0039）。與原發(fā)腫瘤（43.52±15.36）%比較，復(fù)發(fā)腫瘤中的 NS陽(yáng)性表達(dá)率（78.23±15.03）%明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝15.271，P＝0.008）。伴有IDHl突變的復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中NS陽(yáng)性表達(dá)率（79.32±3.55）%較IDHI野生型NS表達(dá)率（50.79±5.14）%增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.384，P＝0.01）。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中較為常見的腫瘤，通過臨床觀察大多數(shù)患者預(yù)后不佳［6］。核干細(xì)胞因子是美國(guó)學(xué)者M(jìn)cK－ay和Tasi于2002年在成年鼠的腦干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新蛋白［7］；IDH雖是人們比較熟悉的蛋白，但研究人員最近才發(fā)現(xiàn)IDH基因的突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能起到非常重要的作用。然而，在異檸檬酸脫氫酶l與核干細(xì)胞因子間是否存在聯(lián)系，此聯(lián)系在膠質(zhì)瘤形成過程中起著什么樣的作用，目前研究仍較少，筆者通過此實(shí)驗(yàn)探討了IDHl多態(tài)性與NS表達(dá)的聯(lián)系。經(jīng)過分析得在原發(fā)性膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤中均可出現(xiàn)較高頻率的IDH1突變，與以往研究結(jié)果相同［8］，且可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤中核干細(xì)胞因子的表達(dá)。

本文結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NS在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的存在，且隨著病理級(jí)別的升高，腫瘤內(nèi)的NS表達(dá)比例升高，這也說明高病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力與侵襲性。通過分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)腫瘤中的IDHl突變與腫瘤病理分級(jí)有相關(guān)性，與以往研究相同［9］。但突變可出現(xiàn)良好預(yù)后的原因及機(jī)制仍未能完全解釋，而要想更全面明確膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并將其理論應(yīng)用于臨床診治膠質(zhì)瘤的工作中，還需大樣本量的實(shí)驗(yàn)室研究與臨床研究。

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